Реферат: Анализ в кабинете врача и на дому
Введение
Наиболееважной тенденцией, в диагностическоймедицине запоследниедесять лет, по-видимому, является уменьшениедоли анализов, проводимыхв центральныхклиническихлабораториях.Все большаячасть диагностическиханализов внастоящее времявыполняетсяили во вспомогательныхлабораториях, или в кабинетеврача, а такжепросто на дому.
Этиизмененияобусловленынесколькимифакторами.Техническиеновшествапозволилиупростить иускорить проведениеанализов приодновременномувеличениинадежностии легкостиинтерпретацииполученныхрезультатов.Кроме того, существуюти экономическиепричины децентрализациидиагностики.Например, в СШАпо программеMedicareпроизводятсяперспективныевыплаты больницамза оказаниемедицинскойпомощи, т.е. дотого, как этапомощь оказана.Эта программастимулируетпроведениеобследованияпациента внебольшихклиниках икабинетахврачей. Крометого, посколькуэта программапредусматриваетвполне разумнуюоплату за выполняемыена месте диагностическиеанализы, толабораторияв кабинетеврача становитсяпотенциальнымисточникомдоходов. В тоже время современныетехническиедостиженияпозволяютвнедрять методыанализа в кабинетеврача беззначительныхзатрат наприобретениеоборудованияи обучениеперсонала.
Ростколичестваанализов, выполняемыхнепосредственнона дому, обусловленв большой мережеланием строжеследить засвоим здоровьем.Постоянноусиливаетсятенденция косознаниюважности проблемыздоровья, особеннов тех случаях, когда потенциальныезаболеваниясвязаны с образомжизни. Экономическиетенденции такжеспособствуютразвитию производствааналитическихсистем длясамодиагноза.Например, желаниемногих работающихженщин повременитьс рождениемребенка, несомненно, стимулируетинтерес к тестамдля предсказанияовуляции ираннего обнаружениябеременности.Рынок наборовдля анализовна дому, которыйдесять летназад в основномбыл ограниченвыпускомдиагностикумовдля контроляза диабетом, в ближайшеедесятилетиев денежномвыражениисоставит околоодного миллиардадолларов.
Самодиагностикуи диагностикув кабинетеврача можноусловно подразделитьна три основныегруппы в соответствиис определяемымисимптомамиили болезнями.Первая группавключает контрольза хроническимизаболеваниями.Ко второй группеотносятся тестыдля диагностикисимптоматическихзаболеванийили состояний, например беременностиили ангины. Втретью группувходят тестыдля определенияасимптоматическихсостояний, таких, как ракили овуляция.Во многих изэтих тестовприменяютсяметоды иммуноанализа, в то время какдля определения, например, глюкозыиспользуютдругие методы.
Многиеанализы выполняютсяи в лабораторияхпри кабинетеврача, и на дому; часто они основанына одних и техже или оченьблизких методах.Как правило, однако, аналитическиесистемы, длясамодиагнозане предназначеныдля оценкиусловий, связанныхс опасностьюдля жизни человека.Исключениесоставляетопределениеглюкозы в кровибольных диабетом, когда полученныерезультатымогут использоватьсяв инсулиновойтерапии.
Другоеважное различиемежду анализамив кабинетеврача и на домусвязано соспособом отборапроб. В случаесамодиагнозадля полученияпроб, как правило, используютсянеинвазивныеметоды, т.е. отборпроб мочи илифекалий. Мочачаще всегоиспользуетсяв домашнихдиагностикумах.И снова исключениесоставляетконтроль глюкозыу больных диабетом, где проба кровиотбираетсяиз пальца спомощью укола.Напротив, влабораторияхпри кабинетеврача для отборапроб крови извены, ректальных, генитальныхили горловыхмазков могутбыть использованыразличныеинвазивныеметоды.
Связанныес отбором пробограничениянесомненносказываютсяна спектреанализов, осуществляемыхс помощью домашниханалитическихсистем. Обычноне представляетпроблемы заставитьсебя проколотьпалец для отборапробы крови, однако оченьнемногие избольных смогутсебе сделатьректальныйили уретральныймазок. Крометого, посколькурезультатыанализа нанекоторыеинфекционныезаболеванияв очень большойстепени зависятот правильностивыполненияпроцедурыотбора пробы, то выполнениеэтой процедурынельзя доверятьдаже самымхрабрым пациентам.
1.Методология
Децентрализациялабораторныханализов привелак разработкеновых методов, наиболее полносоответствующихновым условиямвыполненияанализов. Напримере одногостарого и трехновых методовпроиллюстрируемниже основныетенденцииразвития этойобласти иммуноанализа.
1.1Агглютинация
Реакцияагглютинации, т.е. сшиваниеантиген-сенсибилизированныхклеток иличастичек спомощью соответствующихантител, известнауже давно идетально описанав иммунологическойлитературе.Агглютинационныетесты можноиспользоватьдля определениякак антигена, так и антителав зависимостиот того, какойреагент связываетсяс твердой фазой.Известен прямойи конкурентныйварианты реакции.
Большинстводомашниханалитическихсистем дляобнаружениябеременностиосновано наингибированииреакции гемагглютинации.В таких тестахсмешиваютэритроциты, сенсибилизированныеhCG, специфическиеантитела ипробу мочи, вкоторой необходимоопределитьhCG.При наличиив пробе hCGнеаттлютинирующиеклетки скатываютсяпо стенкампробирки внизи образуют надне красноекольцо. Приотрицательномрезультатеклетки за счетагглютинацииостаются всуспензии.
Агглютинационныетесты оченьхорошо подходяткак для самодиагноза, так и для лабораторийпри кабинетеврача, посколькуони очень простыи не требуютникакогооборудования.Однако почувствительностиони сильноуступаютиммуноферментнымметодам анализа, так как в нихсигнал неусиливается.К тому же интерпретацияполученныхданных довольносубъективна, а сами агглютинационныетесты подверженыслучайныммеханическимвоздействиям, сотрясениям, которые могутразрушатьобразующиесяструктуры иприводить кнеправильнымрезультатам.Кроме того, приналичии в проберевматоидногофактора илимолекул типабелка А возможнанеспецифическаяагглютинация.Подобные белкуА веществанаиболее опасныпри диагностикеинфекционныхзаболеваний, поскольку ониимеются наповерхностимногих обычныхмикроорганизмов.
Иммунофильтрация.Под иммунофильтрациейпонимают определениевещества методомиммуноанализапосле его выделенияиз пробы фильтрациейчерез полупроницаемуюмембрану. Внаиболее простомварианте антигенудерживаетсямембранойнеспецифически, только благодаряопределенномуразмеру ее пор.Далее его определяютс помощью конъюгатафермент – антитело.Этот методиспользовандля определенияассоциатоввирусов с клетками, однако он неприменим крастворимымантигенам илисвободнымвирусам. В этомслучае необходимыйантиген специфическисвязывают сантителамина мембране.
Принципиммунофильтрациииспользованв наборе ICON™для определенияhCG.Набор включаетполипропиленовыйцилиндр с найлоновоймембраной, вцентре которойиммобилизованыантитела. Мембраналежит на дискеиз пористогополиэтилена.Внутри цилиндрзаполнен адсорбентом, например ацетатомцеллюлозы.Сначала мембранусмачиваютбуферным раствором.Затем наносятпробу, котораяпроходит черезмембрану иулавливаетсяадсорбентом.Присутствующийв пробе hCGсвязываетсяс иммобилизованнымиантителами; его обнаруживаютдобавлениемконъюгатафермент – антитело.После отмывкиизбытка конъюгатадобавляютраствор субстрата; при наличиив пробе антигенанаблюдаетсяцветная реакция.При положительномрезультатеанализа в центремембраны появляетсяголубое пятно.
/>
Посравнению спассивнойсорбцией натвердой фазев иммунофильтрациисвязываниеантигена сантителомускоряетсяпримерно в 10раз и кинетикапроцессов почтине отличаетсяот кинетикиреакций в растворах.Например, еслиопределениеhCGс чувствительностью50 ед./л по ингибированиюагглютинациизанимает около1 ч, то с помощьюнабора ICON™это время сокращаетсядо 5 мин. Чувствительностьаналитическихсистем, основанныхна принципеиммунофильтрации, зависит отобъема наносимойпробы, времениинкубации сконыогатоми субстратом.На чувствительностьне влияетконцентрацияконъюгата, поскольку онберется в большомизбытке поотношению копределяемомувеществу.
Дляобеспеченияспецифичностив анализе используютдва типа моноклональныхантител, одиниз которыхспецифиченк бета-субъединице, а второй – кальфа-субъединицегормона. Еслидля связыванияприменяютмоноклональныеантитела кальфа-субъединице, то на мембранекроме hCGтакже будутспецифическисорбироватьсядругие гормоны, альфа-субъединицыкоторых даютперекрестнуюреакцию сальфа-субъединицейhCG.В этом случаеспецифичностьопределенияhCGне изменится, однако благодаря«хук» – эффектуможет оказатьсязаниженной.Это явлениеобусловленотем, что привысоких концентрацияхдругие гормонымогут конкурентнозанимать активныецентры антител, в результатечего сигналполучитсязаниженным.Поэтому предпочтительнееантитела противбета-субъединицыиммобилизоватьна мембране, а антителапротив альфа-субъединицыконъюгироватьс' ферментом.
/>
Влитературеописано несколькодругих вариантовметода иммунофильтрации.В одном из нихантитела иммобилизуютне непосредственнона мембране, а на гранулах, расположенныхна поверхностиили внутримембраны (рис. 3).Гранулы симмобилизованнымиантителамимогут бытьпомещены нафильтр заранееили непосредственноперед проведениеманализа. Преимуществомпоследнеговарианта являетсявозможностьсмешиванияи подбора различныхреагентов ифильтров.
Другимпреимуществомметода иммунофильтрацииявляется простотаположительногоконтроля. Контрольможет бытьзависимым илинезависимымот определяемоговещества. Впервом случаеhCGпросто иммобилизуютна определенномучастке мембраныдля регистрацииположительнойактивностиконъюгата. Вовтором случаена каком-либоучастке мембраныиммобилизуютантитела противфермента, скоторым конъюгированывторые антителак определяемомувеществу; здесьсвязываниефермента сэтими антителамине должно влиятьна его активность.Преимуществомположительногоконтроля, независящегоот определяемоговещества, являетсявозможностьподбора такихантител кконъюгированномуферменту, стабильностькоторых совпадетсо стабильностьюантител, используемыхдля связыванияантигена изпробы. Такимобразом, будетосуществлятьсяодновременныйконтроль какактивностииммобилизованныхантител, таки активностиконъюгата.Недавно в продажепоявиласьмодифицированнаяаналитическаясистема дляколичественногоопределенияhCG.В ее составвходят двастандарта исчитывательICON.
1.2Ферментативнаяиммунохроматография
Ферментативнаяиммунохроматографиятакже потенциальноможет широкоприменятьсядля диагностикина дому и в кабинетеврача. Этотметод предназначендля определениягаптенов, которыев настоящеевремя в основномопределяютс помощьюконкурентныхметодов иммуноанализа.Ферментативнаяиммунохроматографиянапоминаетиммуноанализс ферментативнымусилением, однако междуними есть исущественныеотличия.
Вметодах типаEMITгаптен и конъюгатгаптен– фермент конкурируютмежду собойза ограниченноеколичествоантител противопределяемогосоединения.Связываниеконъюгата сантителомприводит кизменениюферментативнойактивности.В общем случаесвободныйконъюгат активен, а в комплексес антителомнеактивен.Таким образом, чем большеопределяемогосоединениянаходится вобразце, тембольшая доляконъюгатаостанетсянесвязаннойи тем болеевысокой будетферментативнаяактивность.
Вферментативнойиммунохроматографиитакже используютсяконъюгат ферментас определяемымвеществом испецифическиеантитела противпоследнего.Однако в отличиеот EMITздесь определениене связано сизменениемактивностиконъюгата вкомплексе сантителом.Принцип методаферментативнойиммунохроматографиипредставленна рис. 6.4. Определенныйобъем пробысмешивают сраствором, содержащимконъюгат фермент– гаптен исоответствующийферментныйреагент. Врассматриваемомпримере сопряженнымферментомявляется пероксидазаиз корней хрена, а ферментнымреагентом –глюкозооксидаза.Глюкозооксидазапри окисленииглюкозы генерируетпероксид водорода– субстратпероксидазы, в результатечего отпадаетнеобходимостьвключать всостав наборовнестабильныепероксидныереагенты. Сухуюполоску фильтровальнойбумаги с иммобилизованнымина ней антителамипротив определяемоговещества помещаютв раствор пробыи других реагентов.Реагирующиевещества поддействиемкапиллярныхсил поднимаютсяпо полоскевверх. Глюкозооксидазараспределяетсяпо длине полоскиравномерно, а высота подъемаопределяемоговещества иконъюгатазависит от ихотносительныхконцентраций.После инкубациив течение несколькихминут полоскупереносят впроявляющийраствор, состоящийиз глюкозы ихромогенногоиндикатора.В ходе ферментативнойреакции образуетсяокрашеннаязона, высотакоторой пропорциональнаконцентрацииопределяемоговещества впробе. Следовательно, здесь конъюгатиспользуетсятолько в качествемаркера дляопределениядлины пробегаопределяемоговещества пополоске, а активностьфермента присвязыванииконъюгата сантителом неизменяется.
/>
Дляопределениятеофиллинас помощьюферментативнойиммунохроматографиитребуется около15 мин. Чувствительность, специфичностьи точностьанализа сравнимыс соответствующимихарактеристикамиметода EMIT.Для проведенияанализа нетребуетсяникаких приборов, окрашеннаяполоска стабильнав течение годапри хранениив темноте. Методможно применятьдля анализапроб крови, если к первомураствору добавитьагент, агглютинирующийэритроциты, напримерантисывороткубарана. До настоящеговремени положительныйконтроль втаких аналитическихсистемах неприменялся.
1.3Иммуноанализссамоудерживанием
Длядиагностикина дому и в кабинетеврача применяетсятакже так называемыйиммуноанализс самоудерживанием.Как и в иммунофильтрации, в нем использованныежидкости остаютсяв устройстведля анализа, однако в отличиеот последнегов ИАСУ нетнеобходимостив многочисленныхстадиях добавленияреагентов ипромывки. ПринципИАСУ, разрабатываемыйфирмой BiotopeInc.под торговоймаркой BioMAT-EIA™, представленна рис. 6.5. Основойэтого методаявляютсянесмешивающиесярастворы реагентов, расположенныеслоями и обеспечивающиепоследовательноепроведениереакций и отделениесвязанныхреагентов отнесвязанныхinsitu.Описанатакже модификацияBioMAT™с использованиемрадиоиммуноанализа.
Втипичном гетерогенноманализе самыйверхний слойсодержит связанныес антителамигранулы, предварительносмешанные сферментнымконъюгатом.Гранулы диаметромнесколькомикрометровпозволяютзначительноускорить реакциюантиген – антителопо сравнениюс трубками илигрануламибольших размеров.Реакцию начинают, вводя пробув анализаторчерез самоуплотняющуюсямембрану. Послеинкубации дляобеспеченияспецифическогосвязыванияанализаторнедолго центрифугируют, заставляягранулы пройтичерез не смешивающийсяс водой слой.На этой стадииот гранул отделяетсянесвязавшийсяконъюгат. Далеегранулы попадаютв нижний слой, содержащийпроявляющийдля даннойферментнойметки раствор.Появление цветанаблюдаетсятолько в нижнейчасти пробирки.Интенсивностьокраски можнооценить визуальноили с помощьюспециальногоколориметра.Стадия центрифугированиязанимает неболее 1 мин, авсе необходимыедля анализареагенты находятсяуже в пробирке.В анализатордобавляюттолько изучаемуюпробу. В принципевозможен ивнутреннийконтроль, еслив анализаторввести гранулы, с которымисвязано определяемоевещество, причемплотность этихгранул должнаотличатьсяот плотностигранул с антителами.Тогда послецентрифугированияна другой высотепоявится ещеодна окрашеннаяполоса.
/>
Еслицентрифугированиепо каким-либопричинамнежелательно, то для разделенияможно использоватьнамагниченныегранулы и магнитноеполе. МетодBioMATможно адаптироватьи для других, более чувствительных, систем обнаружения, например путемизмеренияфлуоресценциис временнымразрешением.В методе BioMAT-FIA™антитела могутсодержатьлантанидныеметки, которыепосле связыванияс определеннымихелатирующимиагентамифлуоресцируютнеобычно долгоевремя. Такимобразом, можноподавить влияниесобственнойфлуоресценциипробы. Однакомаксимальнуюинтенсивностьфлуоресценциилантанидныекомплексыпроявляют вневодном окружении, поэтому в обычныхметодах вводятдополнительнуюстадию переводапробы в неводнуюсреду. Эта операцияв BioMAT-FIA™исключаетсяза счет использованияэкстракционныхматериаловв гидрофобномслое анализатора.
2.Перспективыи тенденцииразвития
2.1Совершенствованиеметодологии
Напримере описанныхвыше подходови методов можновыделить рядфакторов, существенныхдля дальнейшегоразвитияаналитическихсистем длясамодиагнозаианализовв кабинетеврача. Эти системыдолжны включатьвнутреннийконтроль, даватьлегко интерпретируемыерезультаты, не требоватьточного пробоотбораи строгогоконтроля повремени.
Длятаких системвнутреннийконтроль особенноважен, посколькуздесь невозможныконтроль качестваанализов испециальныепроверочныесхемы. Внутреннийконтроль обеспечиваетпотребителюкак надежностьрезультатаанализа, таки данные осохранностиреагентов.
Внекоторыхслучаях, напримерпри диагностикебеременностиили инфекционныхзаболеваний, достаточнокачественногорезультата.В наборах TestPack™фирмы Abbotна hCGи стрептококкигруппы А знак«плюс» соответствуетположительномурезультату, а знак «минус»– отрицательномурезультату.Отсутствиекакого-либознака свидетельствуето неправильномпроведениианализа.
Внастоящеевремя активноразрабатываютсяаналитическиесистемы, нетребующиеточной дозировкиреагентов.Приспособлениедля отбора пробв наборе BioMAT™, позволяющеевыполнятьколичественноеопределение, по-видимому, является наиболееярким примеромэтой тенденции.В других аналитическихсистемах, вкоторых приемлемкачественныйили полуколичественныйрезультат, длядозировкиреагентовиспользуютсяфлаконы-капельницыи некалиброванныепипетки.
Независимостьконечногорезультатаот длительностиотдельныхопераций особенноважна в кабинетеврача, посколькуобслуживающийперсонал можетвыполнятьнесколькофункций и длянего трудноточно выдерживатьвремя каждойоперации. Учитываяэтот фактор, фирма Biofopeразработаламодифицированныйвари-' ант анализатораBioMAT™, в которомдлительностьопераций инкубациии промывкинаходится подтермоконтролем.Материал промывочногослоя в этоманализаторетвердый прикомнатнойтемпературе, но плавитсяпри нагреваниидо 37°С и такимобразом открываетдоступ к плотнымгранулам. Такиефазовые измененияпозволяютавтоматизироватьстадии инкубации, промывки ицветной реакции, причем необходимостьв переносекаких-либочастей системыили жидкой фазыотпадает, авремя операцийопределениярегулируетсясамой аналитическойсистемой.
2.2Этическиепроблемы
Дальнейшееразвитие самодиагнозаи диагноза вкабинете врачасвязано с решениеммногочисленныхвопросов этикии безопасности.Лица, не имеющиеспециальнойподготовки, могут безоглядноположитьсяна результатыиспользуемыхими наборовдля самодиагнозаinvitro.Приэтом ложныйотрицательныйрезультатприведет ктому, что больнойне получитвовремя соответствующейквалифицированноймедицинскойпомощи. Ложныйположительныйрезультат можетоказать влияниена психическоесостояниепациента. Такимобразом, наборыдля самодиагнозане устраняютпринципиальныхразличий междусамотестированиеми самодиагностикой.
Увеличиваетсяответственностьи врачей, которыена основаниирезультатованализа с помощьюсвоих аналитическихсистем выбираюттот или инойпуть лечениябольного. Раньше, если больномубыл нанесенущерб в результатенеправильногоанализа, ответственностьвозлагаласьна лабораторию, в которой этотанализ былвыполнен.
Развитиерынка аналитическихсистем длядиагноза надому в ближайшембудущем, по-видимому, будет находитьсяпод все болеестрогим контролем.В США наборыдля диагнозаinvitro,предназначенныедля примененияна дому и в кабинетеврача, как, впрочем, и все другиенаборы, должныполучить разрешениеУправленияпо контролюза качествомпищевых продуктов, медикаментови косметическихсредств. Крометого, в регулированиипродажи и примененияэтих аналитическихсистем большуюроль играютдругие профессиональныеорганизации, группы по защитеинтересовпотребителейи, возможно, даже самифирмы-производители.Недавно назаседанииАмериканскойфармацевтическойассоциациибыла рассмотренарезолюция, призывающаяк распространениюдомашних наборовдля самодиагнозаinvitroтолькочерез аптеки.Резолюция былаотклонена восновном из-занекоторыхнеоднозначностейв терминологии.К наборам длядиагноза invitroможноотнести различныеустройства, например термометр, на которыйдействие резолюциине должнораспространяться.Тем не менее, по крайней мереодна крупнаяфирма решилараспространятьвыпускаемыенаборы длядиагноза invitroтолько черезтак называемыеответственныецентры, т.е.магазины, специализирующиесяна продажепредметовмедицинскогоназначения, персонал которыхпоможет потребителюквалифицированновыбрать ииспользоватьнеобходимыенаборы.
Внастоящее времядискутируетсявопрос о возможностиширокогораспространенияаналитическихсистем длядиагноза инфекционныхзаболеванийна дому и в кабинетеврача. Высказывалосьмнение о целее образностинаборов длясамодиагнозавенерическихзаболеваний, однако авторыэтой статьисчитают, чтодиагностированиетаких заболеванийдолжно осуществлятьсяв клинике илиспециальнойлаборатории.Из-за отсутствияпрямой связимежду результатомтестированияи методом лечениязаболеваниядо сих пор остаетсянеясным будущееаналитическихсистем длядиагноза надому даже техинфекционныхзаболеваний, которые ненуждаются врегистрации, например воспалениямочевого трактаи ангины.
2.3Правовые аспекты
ВСоединенныхШтатах будущееаналитическихсистем длякабинета врача, по-видимому, также частичнопопадет подконтроль федеральныхправовых актов, которые будутограничиватьрост цен и видыанализов, проводимыхпо системегарантированнойоплаты.
Практикаскрининганаркотиковуже нашла широкоеприменениев некоторыхсекторах обществаи быстро распространяетсяна другие. Донедавнеговремени анализына наркотикив основномпроводилисьв армии США, вцентрах полечению отнаркоманиии специализированныхклиниках. Однаков настоящеевремя около18% фармакологическихкомпанийразрабатываютпрограммы поскринингунаркотиков, и ожидается, что еще многиедругие компанииприсоединятсяк этим исследованиям.Президентскаякомиссия поборьбе с организованнойпреступностьюрекомендовалавсем федеральнымагентствамучитыватьпрограммыскрининганаркотикови заключатьфедеральныеконтрактытолько с такимичастными фирмами, которые осуществляютподобные программы.Эта рекомендациябудет способствоватьразработкесоответствующихтестов дляпроведенияанализа нарабочем месте.Будущее аналитическихсистем дляобнаружениянаркотиковна дому и в кабинетеврача будетв основномопределятьсясоответствиемразработанныхпрограмм скринингаюридическимнормам.
Заключение
Техническиеновшества иэкономическиефакторы привелик тому, что центртяжести в проведениианализов сдвигаетсяот большихцентрализованныхлабораторийк анализам надому или в кабинетеврача. Этотсдвиг ускоряетсяза счет развитияновых методов, позволяющихвыполнятьанализы с помощьюболее простыхопераций ивключающихсистемы внутреннегоконтроля дляпроверки правильностирезультатованализа иработоспособностивсех компонентовсистем примаксимальнойпростоте последних.Вдальнейшемдля потребителянаиболее полезнымибудут методы, позволяющиеопределитьбольшое количествосоединений.
Помимотехническихзадач децентрализацияпроведенияанализов породиларазличныеэтическиепроблемы, связанныес безопасностьюи применениемнаборов длядиагноза invitro.Такиенаборы в будущембудут контролироватьсястроже, особенноесли они предназначеныдля самостоятельногоприменения.Вчастности, предполагаетсяразработатьзаконы, обеспечивающиеповышениекачества выпускаемыхнаборов, а такжеряд правовыхактов, направленныхна усилениеконтроля застоимостьюмедицинскогообеспеченияи охрану гражданскихправ.