Реферат: Серологические реакции

2СЕРОЛОГИЧЕСКИЕРЕАКЦИИ

СЕРОЛОГИЯ — раздел иммунологии, изучающий взаимодействие АГ

и АТ впробирочных реакциях (in vitro).

Серологические реакции — реакции сиспользованием АГ или АТ

(проводящиеся invitro).

Серологическими методами (в диагностике инфекционных заболе-

ваний) называютсовокупность пробирочных реакций, основанных на

АГ-АТ-взаимодействии./2640к/99/

1) Направленны на выявление в сывороткекрови и других жид-

костях организмаАТ к АГ возбудителей инфекционных болезней.

2) Проброчные реакции, имеющие целью обнаружение в сыворотке

крови и других субстратах растворимых микробных АГ с помощью

стандартныхиммунных сывороток.

Серологические реакции проводятся сиспользованием

1) АГ для поиска АТ

2) АТ для поиска АГ

4+ 0 /?/ 4 IN VIVO (кожныепробы, РН in vivo ...)

4- серопрофилактика (введение АГ,АТ)

4В серологчиеские методы не входятреакции, которые ставят на

4людях илиживотных (реакция Шика, Дика), исерологическая иден-

4тификациякультур микроорганизмов (это один из этапов бактерио-

4логическогометода.

КЛАССИФИКАЦИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХРЕАКЦИЙ

1. Двухкомпонентные

— простые (РА, РП)

— розеточные тесты (РОК)

— цитофлюоресцентные методы

— сложные (РН /гемадсорбции, токсина, ..., РТГА, РНГА, ре-

акция прямойимунофлюоресценции, реакции адгезии).

Реакции адгезии отличаются взаимодействиемчастиц, например,

клетки, ссерологически активной поверхностью, вт.ч. с другой

клеткой. /2260к/

2. Трехкомпонентные

— простые

— реакция бактериолиза,

— реакция коагглютинации

— сложные

— реакция непрямойиммунофлюоресценции,

— РИА,

— РЭМА,

— литические тесты (РСК, определение АОК с помощью

эритроцитарных АГ-ов),

— использование электронного парамагнитного и ядер-

но-магнитного резонанса) /7271/87/,

Материал для серологических реакций:

— сыворотка крови (парные сыворотки). Заморозка в течение

10-14 дней.

— ликвор,

— моча,

— фильтрат испражнений,

— промывные воды бронхов, полости рта,глотки, носа /2640к/,

желудка.

— Слизь (шейки матки,… — здесь АТ поройбольше, чем вы сы-

воротке)

Учет серологических реакций осуществляетсявидуально, иногда

с помощью лупы иредко — микроскопа. /2640к/99/

При оценке серологических реакций применяют3 главных крите-

рия /2640к/99/:

— наличие и интенсивность реакции (в плюсахи др.),

— диагностический титр, заранее отработанный для всех забо-

леваний,

— нарастание титра АТ в течение болезни в 4и более раза.

В процессе оценки серологических реакцийчасто возникает не-

обходимость дифференцировки

1) специфической реакции (на видовые итиповые антигены) от

группоспецифической (на межвидовые АГ) [Группоспец. АГ

Salm. — табл.]

4-- дифференцировка помоноспецифическим антисывороткам,

4-- по скорости нарастания титраАТ, которая выше к специ-

4фическим АГ, 0

4-- по реакции адсорбции АТизбытком антигена

4-- по легкости диссоциации ИК под влияниемдиссоцирующих

4факторов 0

2) ИО на текущую инфекцию от ИО на перенесенноеранее заболе-

вание ииммунизацию. /2640к/99/

5-- Оценивают по темпу нарастанияАТ.

При постановке любой серологической реакции параллельно с

опытом ставятся _контроли на каждый компонент реакции .:

— микробная культура не должна образовыватьхлопья при ана-

логичномвстряхивании;

— сыворотка и антисыворотка не должны быть с хлопьями

(хлопья появляются в процессе хранения белков в связис посте-

пенным оголениемуглеводных компонентов; углеводныекомпоненты

белков, будучи жесткими разветвленными структурами,«запутыва-

ются друг вдруге", обуславливая агрегацию белков);

— эритроциты не должны быть лизированы;

— сыворотка морской свинки, используемая как источник комп-

лемента, должнализировать эритроциты (т.е. работать):компле-

мент + ЭБ — лизис;

— диагностикум не должен содержать хлопьев ипр.

— при поиске АГ обязательно используетсяпараллельно музей-

ный АГ, которыйдолжен однозначно выявляться при проведении ме-

тодики (это значит, что все компоненты реакции«работают», ме-

тодика поставленаправильно).

3РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ/РА/

РА — реакции склеивания микробов, частиц латекса или эрит-

роцитов /реакциягемагглютинации - РГА/. АГ-несущие частицы

склеиваютсяантителами и выпадают в видимый осадок.

1Титром сыворотки 0 считают максимальное разведение, дающее

агглютинацию АГ.

┌ ┐

0 0 0 0 0 = │ 0 0 │

/ / / / / / │ / / /│

│ │ │ │ │ │ ││ │ │ │

└ ┘n

0 — клетка

>── — молекула антитела

1) _ 2Прямая РА

В этой реакции антитела (агглютинины)непосредственно агглю-

тинируюткорпускулярные АГ (агглютиногены).

— 1Зернистая 0 агглютинацияпроисходит при склеивании микробов,

содержащихО-антиген.

— 1Хлопьевидная 0 агглютинацияпроисходит с бактериями, имеющи-

ми жгутики(Н-антигены).

а) 2Прямая реакция агглютинации (РА)

— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле)

1Постановка реакции:

│Микробная суспензия

│+ антисыворотка к микробу

1Результат: 0 — хлопья(агглютинаты)

5Для определения микробного вида (серотипирования) на пред-

5метноестекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностической сыво-

5ротки, разведенной физиологическим раствором 1:25. На вторую

5половину стекла наносится капля физиологического раствора

5(контроль). К каждой капле добавляется равный объемиспытуемой

5культуры.Слегкапокачивая стекло, наблюдать затечением реак-

5ции: феномен агглютинации проявляется выпадением хлопьев и

5просветлениемжидкости в капле. В контролемикробная культура

5должнаостаться мутной и гомогенной. 0

— _Развернутая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)

1Постановка реакции:

│Сыворотка больного, содержащая АТ к микробу — рас-

│ титровка

│+ микробная суспензия (равное количество во все про-

│ бирки или лунки

1Результат: 0 — хлопья(агглютинаты) микробов

5Для определения антител в сыворотке крови больного поста-

5вить вштатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл фи-

5зиологическогораствора. Добавить в первую пробирку 0,5мл сы-

5вороткибольного, разведенную в 50 раз, перемешать. 0,5 мл из

5первойпробирки перелить во вторую, перемешать;из второй про-

5бирки 0,5мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вы-

5лить дляравенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каж-

5дуюпробирку добавляют по 2 капли антигена или диагностикума.

5Оформить 2 контроля — контроль антигена (для исключения спон-

5таннойагглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении

51:50.

5Рабочая схема РА:

5──────────────────────────────────────────────────────────────

5Ингредиенты │ Ряд пробирок

5│------------------------------------------------

5│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7

51.Физраствор 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5

52.Сыворотка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

5больного 1:50

5Полученные

5титры 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:50 -

53.Диагнос-

5тикум в

5каплях 2 2 2 2 2 - 2

5Инкубация в термостате 2 часа при370С, затем при

5необходимости 24 часа прикомнатной температуре.

5Учет результатов реакции проводятчерез 24 часа по следующей

5схеме:

5++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, выраженный

5осадок;

5+++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен;

5++ или + сомнительная реакция, жидкость равномерно мутная,

5осадок отсутствует. 0

5- отрицательная реакция, жидкостьравномерно мутная,

5осадок отсутствует.

5Титром агглютинирующей сывороткисчитается то ее максималь-

5ноеразведение, при котором еще происходит реакция не менее,

5чем на триплюса.

5Артефакты:

5- наличие СРБ, агглютинирующего микробы (стафилококки,

5стрептококки)

5- наличие перекрестных антигенов

б) 2Прямая реакция гемагглютинации(РГА)

— вирусами (эритроцитов любого видаживотного)

— при смешивании двух разногруппных пробкрови (определе-

ние групп крови)

1Постановка реакции:

│Субстанция, склеивающаяэритроциты (сыворотка, вирусы)

│+ эритроциты — хлопья

1Результат: 0 — хлопья (означаютприсутствие АТ)

1Варианты постановки:

— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле)

— _Развернутая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)

5Материал с вирусом титруют от 1/10 до1/1280. 0,5мл данного

5материаласмешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов. Инкубируют 30 ми-

5нут при37оС или 45 минут при комнатной температуре. Титром ви-

5русасчитается его наибольшее разведение, прикотором наблюда-

5етсяагглютинация эритроцитов.

5Прямая гемагглютинация, вызываемаябактериями, коррелирует с

5ихспособностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отража-

5етвирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее ак-

5тивныхклеток из культуры путем их адсорбции на эритроцитах с

5последующимвысевом на плотные среды.)-[11ц301-81]

2) _ 2Непрямая РА

= 2РНГА (РПГА 0;РНГА=РПГА 2) (реакция пассивной 0 2или 0 2непрямойге-

2магглютинации)

1Варианты постановки:

— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле)

— _Развернумая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)

┌ ┐

│ .0. .0. │

│ / / /│

│ │ │ │ │

└ ┘n

К носителю (эритроцитам, стафилококку,частицам латекса /ла-

текс-агглютинация/и пр. химическим способом«пришивают» анти-

гены, ампулируюти выпускают в биотехнологической промышленнос-

ти какдиагностикумы.

1Постановка реакции:

│Сыворотка больного — раститровка

│+ диагностикум в каждую лунку---

1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть),

— «пуговка» (РА нет)

Последняя ячейка с положительной пробой(«зонтиком») означа-

ет титр АТ.

5Сорбция на носителе либо АГ (РНГА=РПГА), либо АТ (обратная

5РПГА).

5Реакция ставится в двухвариантах. Антиген (РПГА) или анти-

5тела(РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выяв-

5лениемуровня специфических иммуноглобулинов или антигена.

5Исследуемый антиген «сшивается» танином или глютаровым ди-

5альдегидомс эритроцитами или частицами латекса.

5Сыворотка больного, прогретая 30минут при 56оС, раститровы-

5вается(0,5мл) и смешивается с 2 каплямиэритроцитарного диаг-

5ностикума.

3) _ 2Проба Кумбса . 0(непрямая пассивная гемагглютинация;

антиглобулиновый тест)

Для постановки этой реакции необходимаантиглобулиновая сы-

воротка,которую получают путем иммунизациикролика иммуногло-

булинамичеловека.

Используется для определения неполных(функционально однова-

лентных) антител, например, «ро»-антителк эритроцитам плода

прирезус-конфликте, ряд аутоантител, АТ к некоторым микробам и

пр. Эритроцитыплода в условиях in vivo не агглютинируют, одна-

ко при обработкеих in vitro антисывороткой к гамма-фракции ан-

тител человекапроисходит РА на стекле (= _ориентировочная . реак-

ция Кумбса). К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и

затемантисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглю-

тинациюзагруженных эритроцитов. _Развернутая . реакция Кумбса (в

ряду пробирок илилунок) применяется для определения титра цир-

кулирующих неполныхантител в сыворотке больного.

┌ ┐

│ 0 0 │

│ / / / /-АТ 41 0│

│ │ │ │ │ │

│ / / / │

│ │ │ │ │

│ АТ 42 0 АТ 42 0 АТ 42 0 │

└ ┘n

1Постановка реакции:

│Сыворотка (АТ 41 0)--- раститровка

│+ эритроциты (с Rh-антигеном)

│+ антисыворотка кFc-фрагменту Ig G (АТ 42 0).

1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть),

— «пуговка» (РА нет)

Последняя ячейка с положительной пробой(«зонтиком») означа-

ет титр АТ.

4) _ 2Реакциякоагглютинации 0 2(РКОА 0, РКА 2)

1Варианты постановки:

— _Ориентировочная РА . (напредметном стекле) — хлопья

— _Развернумая РА . проводитсяв ряду пробирок или лунок для

раститровки сыворотки больного(определения титра АТ)

L[+]

┌ │ ┐

│ ┌─┴─┐ 4 0 │

│0> 4── 0┤St.├ 4─ 0─<0│

│ └─┬─┘ 4 0 │

│ │ │

└ ┘n

К носителю — клеткам инактивированногозолотистого стафило-

кокка (Staphylococcus aureus), несущего на своей поверхности

белок А(функциональный аналог FcR) добавляют необходимые АТ

(антисыворотку) и после инкубации - исследуемую жидкость с

предполагаемымиАГ-ми.

1Постановка реакции:

│Стафилококковый диагностикум

│+ АГ

1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть),

— «пуговка» (РА нет)

Последняя ячейка с положительной пробой(«зонтиком») означа-

ет титр АТ.

5Реакция Ко-агглютинации (РКА) предложена в 1973г. Kronvall

5дляпостановки диагноза пневмококковой инфекции. Сейчас она ис-

5пользуетсядля диагностики эшерихиозов, коклюша,менингококко-

5вой,стрептококковой инфекции, сальмонеллезови шигеллезов, а

5такжедля обнаружения некоторых бактериальных токсинов.

5/2119к/85/

5Реакция пригодна для идентификацииразличных антигенов путем

5агглютинациистафилококков, сенсибилизированных антителами про-

5тивдетерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной при-

5роды./2111к/

5Например, для индикации шигелл зонне в молоке, кефире и в

5материалах от людей. Для определения чувствитель-

5ности РКОАставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной

5взвесишигелл Зонне. Чувствительность РКОА составила 108-109

5микробныхтел в 1 мл взвеси. /2111к/

5Стафилококковый реагент выпускается Ленинградским НИИЭМ им.

5Пастераи используется его 2% взвесь. Для сенсибилизации ис-

5пользуютсясыворотки с титром антител в РПГА не ниже 1:12800.

5/2111к/

5На предметное стекло капают 2 каплипо 0,1 мл диагностикума

5ииспытуемый материал. Положительнымрезультатом считалось об-

5разованиеагглютината с полным просветлением смеси. (Контроль -

5сфизраствором и реакция с заведомоинфицированным материалом.)

4Определение энтеротоксинав реакции

4коагглютинации

4Культуру сальмонелл осаждают (8000 об./мин.;20 минут), к

4осадкумикробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят

4лизат,вновь центрифугируют (8000 об./мин.;20 минут) и с надо-

4садком(супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/

4В реакции используют диагностикум — золотистый стафилококк с

4«пришитыми»к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1

4каплясупернатанта культуры сальмонелл больного — РА (оценка

4+, ++,+++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/

5) _ 2РТГА (реакция торможениягемагглютинации)

Гемагглютинин (НА) вирусов заблокирован антителами (первые

ячейки с" _пуговками ." = РА нет):

L[+]

┌ ┐

│ ┌───┐ ┌───┐ │

│──<0>── │Эр.│ ──<0>── │Эр.│ ──<0>── │

│ └───┘ 7 0 └───┘ │агглютинации

└ ┘эритроцитов

нет

0- вирус (=торможение

>── — антитела агглютинации)

При «следовых» количествах антителк гемагглютитину (НА) или

ихотсутствии гемагглютинин («клей для эритроцитов») вирусов

остается«открытым» (не закрыт антителами) и происходит склеи-

вание эритроцитов(последние ячейки с " _зонтиками ." = РА есть):

L[+]

┌ ┐

│┌───┐ ┌───┐ │

│0│Эр.│0│Эр.│0│

│└───┘ └───┘ │

└ ┘n

а) Определение титра АТ к определенному вирусу (добавляется

антисыворотка кНА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного виру-

са).

1Постановка реакции:

│Сыворотка больного — раститровка

│+ суспензия музейныхинактивированных вирусов

│ (или диагностикум)

│+ эритроциты любого видаживотного

1Результат: 0 — «зонтик» (реакция агглютинации есть, АТ нет

— «пуговка» (РА нет, АТесть

Последняя ячейка с положительной пробой(«пуговкой») означа-

ет титр АТ.

б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у

больного повыделенной культуре

1Постановка реакции:

3 ряда лунок в иммунологическойпланшете:

│Антисыворотка к вирусу гриппатипа А — раститровка

│Антисыворотка к вирусу гриппатипа В — раститровка

│Антисыворотка к вирусу гриппатипа С — раститровка

│+ Вирус-содержащий материал отбольного (культура, но-

│ совая жидкость) во все 3 ряда

│ (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,

│ если нужно сориентироваться в количестве вирусов)

│+ эритроциты любого видаживотного

1Результат: 0 — ряд с «пуговками» означает тип вируса.

5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) — 0,25мл;

5- добавляется вирус в четырехкратномтитре (разведение в 4

5раза отисходного титра)

5- инкубируют 30 минут при 37оС

5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов

5- инкубируют 30 минут при 37оС или45 минут при комнатной

5температуре.

в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у

больного поналичию антител в сыворотке крови

1Постановка реакции:

3 ряда лунок в иммунологическойпланшете:

│Сыворотка больного — раститровка в 3 рядах

│+ Музейный вирус типа А (впервый ряд)

│+ Музейный вирус типа В (вовторой ряд)

│+ Музейный вирус типа С (втретий ряд)

│+ эритроциты любого видаживотного

1Результат: 0 — ряд с наибольшимколичеством «пуговок» означает

наибольший титр АТ убольного к данному типу

вируса, что предположительно говорит о соот-

ветствующем гриппе (длядоказательства оценива-

ют титр АТ в динамике с интервалом в 2 недели;

при увеличении титра минимум в4 раза можно го-

ворить об острой инфекции исоответствующем за-

болевании).

3РЕАКЦИИИММОБИЛИЗАЦИИ

Реакции иммобилизации основаны на способности специфических

АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность

различныхмикроорганизмов.

На практике нашли применение реакции иммобилизации бледной

трепонемы ихолерного вибриона.

3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ(РП)

— реакции взаимодействия между антигеном иантисывороткой с

образованиемвидимого «осадка»(преципитата) — преципитирующих

иммунныхкомплексов (ПИК). 5МАТ(моноклональные АТ) одновалент-

5ные,поэтому в РП пока не используются. 0

┌─────────────────РП ────────────────────┐

_В жидкой фазе . _Вагарозе . (1%)

- реакциикольце- — в т.ч.электрофоретические

преципитации (в этом случае агарозаварится

-нефелометрия наверонал-мединаловом буфере

(ВМБ, рН 8,6)

Механизм взаимодействия антигенов и антител:

АГ │ АГ=АТ │ АТ

(пропорциональное

количество АГ и АТ;1:1)

│ │ │ │ │ │ │

│ │

┌───┐ о о │ / / / / / │ Y Y ┌───┐

<span Courie

еще рефераты

Еще работы по медицине

Иммунопатология (гипо-, гиперчувствительность)