Реферат: Регистрация сигнальных молекул
содержание
стр. Список сокращений введение 1. обзор литературы 1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии 1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens 1.1.2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens
1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов,
перенесенных в растение
1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений
1.2.1. Краткие характеристики ряски 1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК 2. Материалы и методы 2.1. Материалы 2.1.1. Оборудование 2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды 2.1.3. Растения2.1.4. Среды микробиологические для
культивирования растений
2.1.5. Другие растворы 2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии 2.1.7. Антибиотики 2.2. Методы2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с
экссудатами тканей растений
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens 2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну 2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli 3. результаты 4. обсуждение 5. выводы литературы приложениеСПИСОКСОкРАЩЕНИЙ
НУК – нафтиуксусная кислота
БАП – бензиламинопурин
MS –
LB –
тДНК –
Ар – ампицилин
Cs – цефотоксин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы:
Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciensвызывать у растений корончато-галловую болезнь связано с присутствием в ихклетках крупных (95-156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий опухоль). В процессеидентифицирования растений часть генетического материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в растительные клетки иинтегрируется в хромосомы, оставаясь частью наследственного материала. ГенытДНК экспрессируются в трансформарованных растительных клетках, нарушают ихфитогормональный баланс и определяют синтез специфических — соединений.
Таким образом,агробактерии являются природными «генными инженерами», осуществляющийпоразительный по филогенетической дальности перенос генетической информации. Наоснове агробактерий сконструированы эффективные векторные системы длягенетической инженерии растений.
Агробактириальнаятрансформация происходит в результате сложного процесса взаимодействия междубактериальными и растительными клетками. В этом процессе одной из решающихстадий является рецепция агробактериями особых сигнальных молекул,присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные молекулыиндуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ееперенос в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается уширокого круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь увесьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин ограниченийагробактериальной трансформации однодольных считается присутствие в их клеткахсигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.
Цель работы:
Внастоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия такихсигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной работыбыл анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующихпроцессинг тДНК.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетическойинженерии растений
1.1.1.Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens
За последнее десятилетие в области генетической инженериирастений достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методыгенетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессиячужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развитиягенетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевыхобразований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуются присутствием вклетках большой плазмиды, так называемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н.(см. Приложение) [9].
Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных иголосеменных, а так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицированияin vivo необходимоповреждение тканей растения [12].
После прикрепления к клеточной стенке растительной клеткиагробактерии переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, гдепроисходит ее стабильная интеграция в хромосому растения.
Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления кним, а так же вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительныйгеном кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-области, находящихся на Ti-плазмиде [14].
После переноса в ядро растительной клетки, тДНК можетинтегрировать в геном в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства,характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах погиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от семидо тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируютферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время,как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентениладенозин 5'-монофосфат [16].
Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышениюуровня фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этогоявляется повышение митотической активности и образование опухоли. Другие генытДНК кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапини октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которыеслужат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование корончатого галла представляетсобой хорошо охарактеризованный пример генетической инженерии растений вприроде.
Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клеткахагробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма.Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентностьAgrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации, картируемые какна опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы взаимодействияагробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхностирастительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекцииконтролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосомерасположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам растенияявляется одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие. Этотэтап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных между собойхромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируютсяконститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получаютавирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этихлокусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всеххозяев. Локус Chvbопределяет синтез нейтрального циклического b-D-гликана, который трансформируется впериплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального b-D-гликана в инфекционном процессе ещеточно не установлена. Помимо циклического b-D-гликана в прикреплении патогенныхагробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, вчастности внеклеточные экзополисахариды.
Организация vir-геновTi-плазмид. Вирулентные гены агробактерий наTi- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидахзначительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В — Ti-плазмидах в области virлокализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон[Stachel Nester, 1986].Октопиновая Ti-плазмида Arh 5имеет дополнительный локус vir F,расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и — vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериямавирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющихкруг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-областиконтролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительнуюклетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, нои в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах).Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практикеудобные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов«вырезания» тДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессерепликативного синтеза) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этойобласти особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимисяпоследовательностями ДНК размером 24 —, проявляющими значительную гомологиюу всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой областисайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащийначалом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессетранспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнскойклетке и появление ее копии в дочерней.
Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительнуюклетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярностьпереноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерииполностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же каки на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.
На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительнуюклетку – мутации в генах vir B и vir D – оперонов.
1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид
В начале восьмидесятыхгодов были сделаны первые попытки перенести чужеродные последовательности ДНК врастительные клетки либо с помощью транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al.,1980], либо путемсайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией сTi-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Однако, эти ранние эксперименты,основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были довольносложны и трансформации проходили с очень низкой частотой. Необходимо былоразработать более эффективные векторы, чтобы облегчить генетические манипуляциис бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.
Сейчас используют двепринципиально разные системы для введения чужеродных генов в растения с помощьюTi-плазмид:
1. — векторы
2. бинарные векторы.
В основе создания-------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не — для растительныхклеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между границами тДНК, можетинтегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться[Zambryski etal., 1983]. В — векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которуюпредполагается перенести в растения, нужно проклонировать в этом же векторе.
Затем путем гомологичнойрекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмидуреципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним из первых таких векторов наосновании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные засинтез фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.
ДНК pBR322обеспечивала гомологию для — области тДНК pGV3850 с любыми производымиpBR, несущимиклонированный ген.
Гены, кодирующиеразличные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных растений, быливстроены в pGV3850[De Blocle, 1984]. Быларазработана система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al.,1983]. В настоящее времясконструированы и успешно используются и другие — — векторы наоснове Ti-плазмид [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схемы — (А) ибинарной (Б) векторных систем. vir – область вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых можетпроисходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB – левая и праваяграницы тДНК. MCS — — сайт для клонирования. РТМ – маркет трансформации длярастений. RES – маркерустойчивости к антибиотику для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмидыширокого круга хозяев RK2.
Системабинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir могут распологаться на разныхплазмидах [Hockemuet al., 1983]. В такихсистемах обычно присутствуют два элемента:
1) Ti-плазмида-помощник, в которой тДНКпольностью делетирована. Эта плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans.
2) Плазмида широкого круга хозяев,имеющая сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений,ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обе описанные вышесистемы векторов предполагают — этапах сборку нужных конструкций впромежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в готовом виде врецепиентные штаммы агробактерий.
1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciensс механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами илив присутствии — из клеток бактерий можно выделить различныемолекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные,двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут претендовать нароль посредника в переносе генетического материала в растительную клетку[-------, 1980]. Причемкольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной рекомбинации между правой илевой границей тДНК с образованием одной гибридной границы, встречается в оченьмалых количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК,в то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождениерепликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к появлениюодноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование прерывистогосинтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК висходной Ti-плазмиде, если только не допустить возможность существования физическоговырезания материала тДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечныхразрывов в границах. Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главнымнедостатком отошедшей на второй план подобной «эксцезионной модели».Тем не менее, образование двуцепочечных разрывов внутри границ и появлениедетектируемых количеств линейной двуцепочечной формы тДНК при культивированиибактериальных клеток в присутствии — исследователи наблюдали уже через30 минут после добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов — в клеткахагробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма процессированной тДНК[Stachel etal., 1986].
Появлениеэтого интермедиата обнаруживается через восемь часов после добавленияиндуктора, и его количество накапливается на протяжении последующих 40 часовболее, чем в два раза, а затем идет на убыль, показывая, что процесслимитирован.
Какаяиз форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную клетку досих пор остается не выясненным из-за трудности определения относительногоколичества каждой из форм и выявления динамики их превращения. Возможно,процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени и идут сопряженно подобноконъюгационному переносу плазмид, происходящему в месте контакта мембранконъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда все обнаруживаемые интермедиаты могут бытьаберрантными формами прерванного на каком-то этапе неделимого процесса (илинеправильно завершенного). В случае индуцированной экспрессии vir-генов — отсутствует главныйэлемент взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной клетки, и,поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут претендовать на рольпосредника лишь с определенными допущениями. Достоверно известно, что в растительнуюклетку попадает только одна цепь тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже врастительной клетке. Обсуждается, что в случае прохождения в клеткеAgrobacterium tumefaciens — полуконсервативной репликации тДНК втораяцепь может в процессе переноса гидролизоваться, высвобождая энергию длятранспорта переносимой цепи.
1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens
Большинствопервоначальных экспериметнов по генетической трансформации растений было предпринятос помощью заражения пораненных растительных клеток с помощью агробактерий снемодифицированными Ti-плазмидами. Для сохранения стерильности частоинфицировали эксплантаты in vitro вместо целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли всреду цефотоксин или карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональнойсреде.
В дальнейшем по мересоздания обезоруженных векторов и новых селективных маркеров, был разработанболее эффективный метод, дающий большое число трансформантов: кокультивированиеагробактерий с растительными протопластами либо с эксплантантами листьев. Былопоказано, что кокультивирование протопластов с агробактериями, либо сбактериальными --------, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979,Wullems et al., 1981]. Затемподобный подход был успешно применен для трансформации растительных клетокагробактериями, несущими в составе тДНК химерные селективные маркеры [Fraley et al., 1983,Herrera-Estrella et al., 1983].
Этот метод был вдальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методыпригодны только для трансформации растений, которые можно легко регенерироватьиз протопластов (например, табак ипетуния). Эту проблему мрожно легко преодолеть кокультивируя агробактерии слистовыми дисками вместо протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd etal., 1986]. Стерильныелистовые диски — с агробактериями, несущими в составе обезоруженноговектора какой-либо селективный маркер устойчивости к антибиотику. Затем кусочкилистьев культивируют два дня на фидерных чашках со средой для образованияпобегов. После этого их переносят на среду с цефотоксином для уничтожениябактерий и с каким-либо антибиотиком (например, с ---------) для отборатрансформантов. Регенерировавшие побеги дают корни, после чего растенияпереносят в почву для проведения дальнейших экспериментов.
Поскольку методтрансформации листовых дисков представляет собой идеальное сочетание высокой частоты трансформации с легкой ибыстрой — и регенерацией трансформантов, этот подход стали использоватьво многих лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификацииметода. Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было предложено обрабатывать агробактерии--------- [Sheikholeskama. Week S, 1987],который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако метод трансформации листовыхдисков применим для трансформации только тех видов растений, которые могутрегенерировать побеги из недифференцированных клеток в месте поранения.
Наряду с методомтрансформации листовых дисков широко используются конъюгированные агробактериисо стеблевыми сегментами [An et al., 1986], клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами [Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987]. Метод трансформации семянагробактериями был впервые применен для арабидопсиса и заслуживает особоговнимания, так как не требует работы с культурой ткани.
1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных врастение
Чужеродные ДНК,перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов, обычновстраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с законами Менделя [De Block et al., 1984;Horsch et al., 1984].Области ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному.Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах животныхклеток [Smithieset al., 1985; Maniatis, 1985] и недавно подобный подход был успешно применен для трансформациирастений [Paszkowskiet al., 1988].
В большинстве случаевпоследовательности чужеродной ДНК встраиваются в один локус либо в одной копии,либо в виде кластера тандемных вставок, что было показано с помощьюгибридизации insitu [Mouras et al., 1986]. Однако, часто наблюдаются множественные вставки в два или болееучастков на разных хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmanna. Marus, 1987]. В связис этим во многих случах была получена контрансформация физически несцепленныхгенов, сегрегация некоторых проходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpsonet al., 1986].
Чужеродыне гены обычнопередаются потомству с высокой степенью стабильности при мейозе [Muller et al., 1987]. Однако, иногда наблюдали случайнуюпотерю трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].
Возмножно, этопроисходило из-за активации чужеродного гена (например, при метилировании ДНК).Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы, например, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит понеменделевскому типу наследования – по материнской линии.
Используя методгибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа трансформантов и их потомства, многиеисследователи показали, что часто наблюдается встраивание укороченных,тандемных или перестроенных копий чужеродных генов, особенно после прямогопереноса ДНК в протопласты [Krens et al., 1985]. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснитьрядом рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz etal., 1987]. Образованиеинвертированных повторов является основным типом перестроек чужеродной ДНК приприменении векторов, содержащих тДНК — Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987].
Итак, при проведенииопытов по трансформации растений, необходимо принимать во внимание тот факт,что чужеродная ДНК может подвергаться различным модификациям перед встраиваниемв геном хозяина. Однако, и после интеграции могут происходить различные ееперестройки, обычно во время мейоза [Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестноеопыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом ифенотипом дает потомство с предсказуемыми призанаками.
1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов втрансформированных растениях
Для качественного иколичественного анализа экспрессии чужеродных генов в растениях используютмножество методов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et al., 1988] и Вестери-анализ продуктовтрансдукции [Burnette,1981]. Кроме того,изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к антибиотикам игербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов, как cat, npt II, гены октопин- и — разработанычувствительные методы [Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого рода анализ можетиметь большое значение, поскольку можно комбинировать кодирующиепоследовательности репортерных генов с подходящими регуляторнымипоследовательностями растительных генов, либо создавать двойные гены,экспрессирующиеся с одного и того же промотора. Активность гена и промотораможно таким образом определить либо с помощью ферментативного анализа, либогибридизацией растительной РНК с зондами, комплементарными репортерному гену.
Перечисленные вышеразнообразные методики можно успешно применять для анализа экспрессиичужеродных генов в трансгенных растениях, в частности, генов устойчивости кгербицидам, насекомым, облучению, антибиотикам и др.
1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформацииоднодольных растений
1.2.1. Краткие характеристики ряски
Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родови 30 видов, встречающихся на всех континентах. Наиболее широко онираспространены в Северной и Южной Америке, Африке, Австралии. Представители семействарясковые являются самыми маленькими в мире цветковыми растениями, венчикикоторых редко превышают 1 см. В результате гидрофильной эволюции они достигликрайней степени редукции всех своих органов, поэтому и по простоте строениязанимают первое место среди цветковых.
Рясковые –водные, свободноплавающие, большей частью многолетние травянистые растения. Посвоей природе рясковые являются неотеническими формами произошедшими от предковсовременного водоплавающего рода Пистия из семействаАроидных.Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а так же других водоплавающихи болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и ондатры. В сельском хозяйстве ихиспользуют в свежем и сушеном виде как ценный белковый корм для свиней идомашней птицы. Применяются рясковые и для очистки воды, так как извлекают изнее и запасают в своих листьях азот, фосфор, калий, а так же поглощиютуглекислый газ и обогащают воду кислородом. Употребляются и человеком.
За последние50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный экспериментальныйобъект для морфогенетических, физиологических и биохимических исследованийблагодаря неприхотливости к среде, малым размерам, быстрому росту, чтопозволяет использовать всего один генетический клон на протяжении всегоэксперимента.
1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцироватьпроцессинг тДНК
Экспрессию геновvir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы посредством позитивнойрегуляции системы в состав которой входят гены virA и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипцииvir-генов являются низкомолекулярные моноциклические фенольные соединения,синтезируемые в механически поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений являются----------- и довольно широкий круг производных — биосинтетического путиметаболитов защитной природы или предшественников лигнина.
Сигнальные молекулы быливпервые обнаружены в экссудатах корней и листьев двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как — и -------. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденныеткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующаяактивность у большой группы — соединений растительной природы. Механическоеповреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких сигнальныхсоединений. Известно, что — и коричная кислоты, проявляющиесигнальную активность, обладают так же антимикробными свойствами и являютсяпромежуточными метаболитами на пути синтеза -------. — распознаютсяспецифическими рецепторами агробактерий, являющимися трансмембраннымихеморецептргыми белками с различной — к таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессиигенов vir требуется присутствие в эксцудатахрастений различных углеводов: глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы,галактуроновой кислоты, арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы,представляющих компоненты клеточной стенки растений. Такие углеводы связываютсяс периплазматическим доменом рецептора в виде предварительно обработанногокомплекса с белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечныйрезультат индукции процессинга тДНК зависит от синергической активностисигнальных соединений и сахаров эксцудатов растений.
Структурнаяформула:
Позитивнаярегуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию генов vir -----, работает следующим образом.Экспрессируемый конститутивно ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и трансмиссииэтого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный хеморецептор послепринятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G, который в свою очередь выступает в качетвепозитивного регулятора собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir -----. Механизмы активации следующие.
Белок vir A, дважды пронизывающий мембранубактерии, при появлении сигнальных молекул автофосфорилируется — насвоем С-конце, переходя в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальныйдомен белки virA взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируякиназную активность).
Активированный белок vir A в свою очередь — внутреннийклеточный белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al., 1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальныхгенов регулона и со своим собственным, выступая в качестве транскрипционногоактиватора. Индукция vir геновобратимая, и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: вслучае, если хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в егоклетки не осуществляется [Hess et al., 1991].
Кроме позитивнойрегуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие такжехромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного хромосомногомутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов экспрессируются в отсутствие сигнальных молекулрастений.
3. Материалыи методы
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
Копалка, термомиксер5436, центрифуга «Эппиндорф», прибор для горизонтальногоэлектрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.
2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмидыШтамм:Escherichia coli
HB 101
Agrobacterium tumefaciens
C58C1
Плазмиды: рGV3850 тДНК: рBR322 маркер Ар, Тс2.1.3. Растения
В качестве объектовисследования использовали двух–, трехмесячное однодольное растение ряскикрошечной (Lemnaperpusilla).
Растения выращивали втеплице в вегетационных сосудах при температуре 18–250С и 12часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в теплицеподдерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани листьев.Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а затемматериал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в экспериментах поиндукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты двудольные растениятабака красного и льна долгунца.
2.1.4.Среды микробиологические для культивирования растений
В работе использовалисреды:
1. Длямикроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)
NaCl
Дрожжевой экстракт
Бантотриптон
10 мг/л
5 г/л
5 г/л
рН 7,5
Температура 240С
Длина светового дня 16 часов
На чашку Петри:
LB
штамм
10 мл
1 мл
2. Длякультивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча)приведена в таблице.
2.1.5.Другие растворы
Фосфатный буфер
ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)
Саркозилат Na
Проназы – 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозные гели
Фитогормоны:
БАП (6–бензиламинопурин)растворяли в растворе 0,1 – NaOH
HУК (2–нафтилуксусная кислота)растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг/мл. Стерилизовали фильтрованиемчерез фильтры В 485.
Ацетосирингонрастворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл. Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.
2.1.6.Ферменты, используемые в генной инженерии
Гидролиз ДНК проводилирестрикционными эндонуклеазами:
Hind III, Bam Hi, Sal I,Eco RI.
2.1.7.Антибиотики
Ампицилин 50, Н2О 50. Дляселекции бактерий с определенными плазмидами.
2.2. Методы
2.2.1. Инкубация Agrobacteriumtumefaciens с экссудатами тканей растений
Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20циклов/мин) при 290С в жидкой среде LB, собирали центрифугированием исуспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А600– 0,05.
После 5 часов роста в бактериальнуюкультуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья, стебли) вколичестве 2 г на 10 мл среды и продолжали инкубацию в течение 48 часов.
В качетве положительного контроляиспользовали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100мкМ ацетосирингона. В качестве отрицательного контроля использовалиагробактериальные клетки, выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.
Эффективность индукции процессингатДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титржизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений проверяли путемих высева в различных разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили втрех повторностях.
2.2.2. Выделение тотальнойДНК Agrobacterium tumefaciens
ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов совместногокультивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удалялирастительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 370С в 500мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы.Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртоми растворяли в ТЕ–буфере.
2.2.3. Блод-гибридизациятДНК по Саузерну
В целях дополнительной проверкиналичия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий вколичестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорезпри 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярноговеса использовали ДНК фага l, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на –––––фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной системы.
2.2.4. Трансформацияклеток Esherichia coli
Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 370С до концентрации5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессингатДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали тотальнойДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различнуюпереработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашки Петри сагаризированной средой LB,содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В контрольныхэкспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не былподвергнут трансформации и колоний обнаружено не было.
3.результаты
Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК,индуцированного экссудатами анализированных растений, в работе применяли метод«спасения плазмиды», предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот метод основан наиспользовании модифицированной Ti-плазмидыpGV385 [11], содержащей между правой и левойграницами значительно делетированной исходной тДНК бактериальной плазмидывектор pBR322.Таким образом,индуцирование процессинга тДНК в модифицированной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать по вырезанию из нее низкомолекулярногофрагмента ДНК, в состав которого входит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестироватьразличными методами. Один из них – это трансформация клеток E. сoli тотальной агробактериальной ДНК иотбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR322 – устойчивой к антибиотикам. Другимметодом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК с помощью плазмиды pBR322 в качестве гибридизационного зонда.Оба этих метода были использованы в настоящей работе. Сравнили эффективностьиндукции процессинга экссудатами различных растений проведено по отношению кактивности 100 мкМ ацетосирингона. Известно, что это токсифенольное соединение,выделяемое некоторыми двудольными растениями, принадлежит к сигнальныммолекулам, индуцирующим вырезание и перенос агробактериальной тДНК.
Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействиюэкссудатов листьев различных растений представлены в таблице.
Таблица 3.1.
Факторы индукции Количество трансформированных E. ColiL. perpusilla (ряска)
L. perpusilla (ряска)
Ацетосирингон (контроль)
Лен долгунец
Nicotiana tabacum (табак)
Без ацетосирингона и трансформации
25 колоний
30 колоний
35 колоний
40 колоний
30 колоний
–
Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК,что является доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений,специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-плазмиды.
Прямой блод-гибридизационный анализтДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных молекул,индуцирующих образование тДНК [12].
4. обсуждение
Использованный подход позволяет регистрироватьприсутствие сигнальных молекул в экссудатах различных тканей растений по одномуиз важнейших результатов индукции генов области vir, а именно по вырезанию тДНК из агробактериальной Ti-плазмиды. В настоящей работе мыприменили два метода детекции процессинга тДНК модифицированной агробактериальнойTi-плазмиды. PGV3850 [11].
Полученные результаты позволяют расширить списокоднодольных растений (на одно растение), синтезирующих сигнальные молекулы,индуцирующие процессинг агробактериальной тДНК. Примененный метод«спасения плазмиды» позволяет выявлять появление циклических форммодифицированной тДНК pBR322 иее линейных форм [20].
Рассмотренный в работе метод позволяет учитыватьприсутствие в экссудатах растений веществ с бактериостатической активностью.Вещества такой природы могут существенно влиять на эффективность трансформациирастений агробактериями.
Мы не анализировали химическую природу сигнальныхмолекул ряски. Не исключено, что сигнальные молекулы могут отличаться отсигнальных фенольных соединений двудольных растений. Специфический процессвзаимодействия между агробактериями и покрытосеменными растениями существовал,по-видимому, еще до их дивергенции на двудольные и однодольные [15].
Штаммы агробактерий обладают многими особенностями иименно рецепторы (продукты гена vir A),различающиеся по способности узнавать сигнальные молекулы различной природы.
Следует отметить, что растительные вещества ссигнальной функцией для агробактерий не является уникальным примеромсуществования соединений, выполняющих эту важную роль во взаимодействиимикроорганизмов с растенями [22].
Молекулярные сигналы растений играют важную роль вустановлении паразитических и симбиотических взаимоотношений между бактериями ирастениями, определяя при этом круг растений для определенного микроорганизма.Всесторонние структурно-функциональные исследования специфических молекулярныхсигналов во взаимодействии между микроорганизмами и растениями должны ответитьна многочисленные вопросы о молекулярно-генетических механизмах этихвзаимоотношений и способствовать развитию эффективных методов генетическойинженерии важнейших сельскохозяйственных и экологически-индикаторных культурахрастений (как ряска).
Списоклитературы
1.
2.
3.
4.
5
6.
7.
8.
9.
10.
Анализ генома. Методы. Под ред. Н. Дейвиса. – М.: Мир, 1990. – 247 с.
Великов В.А., Бурьянов Я.И. Образование делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850 при конъюгационном переносе из Agrobacterium tumefaciens вEscherichia coli. // Генетика.1998. №8. т. 34. с. 1056-1062.
Великов В.А., Бурьянов Я.И. Изучение конъюгационного транспорта Ti-плазмиды pGV3850из Agrobacterium tumefaciens вEscherichia coli. // Тезисы докладов III Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 27-30 апреля 1998 г, с. 49.
Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. – М.: Мир, 1991. – 408 с.
Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. – М.: Мир, 1988. – 538 с.
Малиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. – М.: Мир, 1984. – 463 с.
Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Под ред. А.И. ----. – Новосибирск: Наука, 1990. – 248 с.
Мобильность генома растений. Под ред. Б. Хол и Е.С. Делинс. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.
Плазмиды. Методы. Под ред. Д. Хорда. – М.: Агропромиздат, 1990. – 272 с.
Пехов А.П. Основы плазмидологии.- М.: 1996. – 231 с.
Сельскохозяйственная биотехнология. Векторные системы молекулярного клонирования. Под ред. Р.Л. Подреперс и Д.Т. Денхардт. – М.: Агропромиздат, 1991. – 535 с.
Солова Г.К., Кривопалов Ю.В., Великов В.А., Чумаков М.И. Прикрепление Agrobacterium к корням пшеницы. // Микробиология. 1995. т. 64. №4, с. 526-530.
Захарченко Н.С., Комиви М.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процессинга тДНК. // Физиология растений. 1999. т. 46. № 2, — с. 282-291.
Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983, V.2, pp. 335-350.
Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 1985, v. 161, pp. 850-860.
Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL – DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, pp. 35-38.
Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119.
Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341-350.
Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., virulence in Agrobacterium tumefaciens. Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167-170.
Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145-1454.
Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143-2150.