Реферат: Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение………………………………………………………………………………………….3

1.    Принципыконструирования рекомбинантных противовирусных вакцин…………..4-24

1.1.  Получение соответствующегофрагмента нуклеиновой кислоты……………....….4

1.2.  Выбор высокоактивной ихорошо изученной в иммунологическом отно-           

      шении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена……9-21

1.2.1.    Получениерекомбинантных ДНК……………………………………………9

1.2.2.    Получениерекомбинантных РНК…………………………………………...11

1.2.3.    Стратегияклонирования генов………………………………………….…13

1.2.4.    Разнообразиевекторных молекул…………………………………………17

1.3.  Выбор системы экспрессииклонированного гена, способной обеспечить

      максимальный выход и функциональную полноценность продукта……………..22

1.4.  Создание достаточно удобныхи по возможности универсальных векторов

       дляцелевой доставки генов в клетки и ткани организма…………………………23

2.    Вакцинапротив лейкемии кошек, изготовленная с помощью генной

      инженерии……………………………………………………………………………….…24

Список литературы…………………………………………………………………………….26

ВВЕДЕНИЕ

Существующие традиционные вакцины, несмотря на очевидный положительныйэффект их широкого применения, обладают рядом недостатков. К ним относятся:наличие нежелательных биологически активных и балластных компонентов впрепаратах, неполноценные иммунологические свойства самих антигенов. Крометого, существуют заболевания, не вызывающие иммунитета, вакцины против которыхвообще отсутствуют и не могут быть сконструированы на основе классическихпринципов. Все это вызывает необходимость усовершенствования уже существующихвакцин и создания принципиально новых типов вакцин. Одним из наиболееперспективных направлений в данной области является получение вакцинныхпрепаратов на основе методов генной инженерии.

 Последним достижением генной инженерии и биотехнологии стало создание рекомбинантныхпротивовирусных вакцин, содержащих гибридные молекулы нуклеиновых кислот.Данные вакцины обладают целым рядом преимуществ. Они характеризуются отсутствием(или значительным снижением) балластных компонентов, полной безвредностью,низкой стоимостью, которая связана с удешевлением промышленного производствавакцин. Экспрессируемый в клетках вакцинированного животного белок имеет конформацию,близкую к нативной, и обладает высокой антигенной активностью.

Таким образом, рекомбинантные противовирусные вакцины являются новейшимпоколением вакцин. Их очевидное преимущество обуславливает широкое применениеданного типа вакцин в медицине и ветеринарии для вакцинации населения исельскохозяйственных животных. 

1. ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯРЕКОМБИНАНТНЫХ                                ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН

Важным условием получения эффективного вакцинного препарата является соблюдениеосновных принципов его производства. Конструирование рекомбинантных противовирусныхвакцин предполагает: 1) получение соответствующего фрагмента нуклеиновойкислоты; 2) выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отношениимодели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена (или генов); 3)выбор системы экспрессии клонированного гена, способной обеспечить максимальныйвыход и функциональную полноценность продукта; 4) создание достаточно удобных ипо возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки иткани организма.

1.1. ПОЛУЧЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТА

НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Для конструирования рекомбинантных РНК или ДНК необходимо получить фрагментнуклеиновой кислоты, который в дальнейшем и будет встраиваться в векторную молекулу.

Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно изхромосомной ДНК, расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом (например,с помощью ультразвука) на сегменты с примерно одинаковой длиной. Выделениегенов с помощью «вырезания» из генома, как правило, состоит изчетырех этапов: 1) получение клонотеки фрагментов генома; 2) выявлениефрагментов генома, содержащих необходимый ген, и точная локализация гена вданном фрагменте; 3) вырезание гена из фрагмента(ов) с помощью рестриктаз исшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы фага Т4, если эти участки получены изразличных фрагментов; 4) амплификация гена в составе векторной молекулы.Указанный способ получения генов является наиболее приемлимым применительно кпротозойным возбудителям, бактериям и для некоторых сложно устроенныхДНК-содержащих вирусов. Такие операции проводятся, в частности, при созданиитак называемых «библиотек генов», то есть набора одинаковых векторныхсистем, в совокупности несущих в себе весь геном данного организма. Однако этотподход имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, очень сложна задачаподбора рестриктаз, позволяющих вырезать из геномной ДНК или клонированногофрагмента генома цельный ген. Как правило, вместе с геном остаются фланкирующиеего лишние нуклеотидные последовательности, что мешает дальнейшему использованиюэтого гена, или же рестриктазы отрезают часть гена, делая его функциональнонеполноценным. Во-вторых, создание клонотеки генома возбудителя представляетспециальную задачу и требует больших затрат времени. Наконец, для рядаДНК-содержащих вирусов (паповавирусы) доказан сплайсированный характер структурыгенов. Вполне понятно, что выделенные гены этих вирусов вследствие наличияинтронных областей не будут проявлять функциональной активности в бактериальныхклетках и окажутся непригодными при решении задач по конструированиюрекомбинантных противовирусных вакцин. В-третьих, если ген составляет незначительнуюдолю от всей геномной ДНК, то возникают большие трудности с его изоляцией иидентификацией.

Наиболее распространенным является путь получения генов через синтезДНК-копий (кДНК) информационных или каких-либо других (в оптимальном случае — индивидуальных) РНК путем их обратной транскрипции. Данный способ включает всебя три этапа: 1) выделение высокоочищенных мРНК, кодирующих индивидуальныеструктурные белки, либо выделение геномных РНК вирусов; 2) синтез двухцепочечнойДНК (гена) на матрицах РНК; 3) амплификация гена с помощью методовмолекулярного клонирования.

Как отмечалось, первым этапом в получении генов с помощью методовобратной транскрипции служит выделение и очистка геномных РНК и мРНК. ГеномныеРНК выделяют главным образом из очищенных вирионов, а мРНК — из инфицированныхклеток.  Для  выделения мРНК из инфицированных клеток используют различныеспособы. В одном из вариантов выделение мРНК из инфицированных клеток проводятнепосредственно из лизированных клеток (лизис осуществляют в денатурирующихсредах в целях предотвращения разрушающего действия нуклеаз на мРНК) споследующей экстракцией фенолом и хлороформом или центрифигурированием лизатачерез подушку 5,7M СsCl (для освобожденияот клеточных ДНК) и заключительной аффинной хроматографией на олиго(dТ)-целлюлозе (поли(У)-сефарозе). Выделение мРНК можнопроводить и из очищенных полирибосом инфицированных клеток.

В случае необходимости получения специфических мРНК, ко­дирующих индивидуальныеструктурные белки возбудителя, исполь­зуют следующий способ.  Инфицированныевирусом клетки разрушают механическим путем или химическими методами (использованиенеионных детергентов). Клеточный лизат освобождают от ядер и митохондрийметодом диф­ференциального центрифугирования и подвергают хроматографии на антительномсорбенте. При этой процедуре с антителами, специ­фичными к определенномуструктурному белку возбудителя, связы­ваются полисомы, осуществляющие синтезэтого белка. Также может быть использован метод непрямой иммунопреципитацииполисом, при котором комплекс антитело — полисома преципитируется из растворадобав­лением второго антитела, специфичного к первому. В качестве второ­гоантитела чаще всего берут фиксированные формалином клетки Staphilococcus aureus, на поверхностикоторых находится так назы­ваемый белок А, имеющий сродство к Fc-фрагментам Ig. Из полисом, полученных одним из описанных способов, далееуже выделяют мРНК.

Другой путь выделения индивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНКвзаимо­действовать с комплементарными ДНК, связанными с твердым носи­телем(целлюлоза, сефароза, нитроцеллюлозные фильтры). Этот ме­тод отбора и очисткиспецифических мРНК является самым эффективным. Однако его применение возможнотолько при наличии соответст­вующих комплементарных ДНК.

Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к ра­ботам посинтезу гена с помощью обратной транскрипции, которую осуществляют с помощьюревертазы AMV в специально подобран­ных условиях. Впроцессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК, а затравкой олиго(dT12-18) (для мРНК, имеющих поли(А)-тракт) или химическисинтезированный олигонуклеотид, комплемен­тарный 3'-концу мРНК. После синтезана мРНК компле­ментарной цепи ДНК и разрушения РНК (чаще используется обра­боткащелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. В этой реакции матрицей служит перваяцепь ДНК. Реакция может катали­зироваться как ревертазой, так иДНК-полимеразой.

После получения двухцепочечной кДНК следует стадия получения гена, заключающаясяв гидролизе одноцепочечного участка ДНК, соединяющего первую и вторую цепи,нуклеазой S1.

Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов: 1)расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданном месте; 2) синтез РНК(ферментативный на ДНК- или РНК-матрицах и химический).

Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в присутствииразличных ферментов. Для этой цели используют ферменты: рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно связанные с олигонуклеотидами(например, стафилококковая нуклеаза), рибозимы (например, рибозим L-19).

Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК(называемой также адресованной, сайт-направленной или сайт-специфической фрагментациейРНК) является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНКферментом РНКазой H в присутствии комплементарныхолигодезоксирибонуклеотидов. Этот метод до сих пор остается наиболееуниверсальным способом направленной фрагментации РНК.

Метод основан на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепьРНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса. К участку РНК, по которому планируется провестиее фрагментацию, синтези­руется комплементарный олигодезоксирибонуклеотиддлиной в 6-10 нуклеотидных остатков. Далее получают комплекс этогоолигонуклеотида с РНК, который затем обрабатывают ферментом. В работе обычноиспользуют РНКазу Н из Escherichia coli — вполне доступный фермент,который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазныхпримесей. Этот метод нашел достаточно широкое применение длясайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК, а также для иден­тификациипродуктов процессинга некоторых РНК.

Важным достоинством рассматриваемого метода является и то, что врезультате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фраг­менты, у одного изкоторых на 5'-конце содержится фосфатная группа, а у другого 3'-конец свободен(нефосфорилирован). Такие фрагменты можно прямо использо­вать в реакцииферментативного лигирования.

Серьезным ограничением этого метода является то, что участок РНК, скоторым связывается комплементарный ему олигодезоксири­бонуклеотид, должениметь однотяжевую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК,представляющей собой в усло­виях расщепления компактную глобулу с развитойвторичной струк­турой. В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть,ис­пользуя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды (15-20-членные),которые предварительно отжигают с частично или полно­стью денатурированной РНК.

Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н вприсутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том, чтов общем случае предсказать, какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе(или в непосредственной близости от него) подвергнется расщеплению, не удается.Более того, фермент зачастую гидролизует не одну, а несколько соседних межнуклеотидныхсвязей. Ясно, что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такиефрагменты могут оказаться непригодными.

Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз, ковалентносвязанных с олигонуклеотидами. Идея, лежащая в основе данного подхода кнаправленной фрагментации РНК, восходит к концу 60-х годов, когда Н. И.Гриневой и ее сотрудниками был предложен метод олигонуклеотид-направляемоймодификации нуклеиновых кислот. Принцип этого метода заключается в том, что с5'- или 3'-концевым остатком олигонуклеотида, комплементарного заданному районуДНК и РНК, связывают модифицирующий агент, который после образования дуплексаатакует одно из ближайших к нему оснований. Реагентами этого типа удалосьнаправленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей, РНК-компонент (M1 РНК) РНКазы Р, а также 16Sрибосомную РНК E.coli.

Однако, как и в случае РНКазы Н, расщепление РНК олигонуклеотид-нуклеазойзачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям, что несколькоограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантныхРНК.

 Для расщепления РНК применяют также рибозимы (природные РНК и синтетическиеполирибонуклеотиды, способные катализировать целый ряд превращений у другихРНК). Первый рибозим, напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции,был получен Т. Чеком. В научной литературе его обозна­чают как рибозим L-19. Этот рибозим представляет собой РНК длиной в 395нуклеотидных остатков, в 5'-концевой области которой имеется гексануклеотиднаяпоследовательность GGAGGG, ответст­венная заспецифичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге. Эта последовательностькомплементарна CUCUCU последовательности, расположеннойна 3'-конце первого экзонного участка предшественника 26SРНК. Если эту РНК заменить другой, но обязательно содержащей доступную длякомплементарного связывания CUCUCUA последовательность,то рибозим L-19 в присутствии гуанозина или гуаниловыхнуклеотидов со свободной 3'-гидроксильной группой расщепит ее.

Источником необходимых участков РНК может служить такой способ, каксинтез фрагментов РНК. Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использованиемразнообразных генно-инженерных конструкций. Однако в настоящее время в подавляющембольшинстве случаев для препаративного получения РНК используютсяРНК-полимеразы, закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов (Т3,Т7 и SP6). Они характеризуются очень высокойактивностью и, в отличие от клеточных РНК-полимераз, состоят из однойполипептидной цепи. Важно также то, что инициация и терминация синтеза РНКэтими полимеразами происходит на одном определенном нуклеотидном остатке.

Полученные одним из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшемвстраивают в векторные молекулы.

Подводя итог изложенному, можно сделать вывод, что получение геновпротективных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу.Однако ее решение необходимо для создания в конечном счете рекомбинантныхпротивовирусных вакцинных препаратов.

1.2. ВЫБОР ВЫСОКОАКТИВНОЙ И ХОРОШО ИЗУЧЕННОЙ В  

ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛИ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ ИКЛОНИРОВАНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА

1.2.1.ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключаетсяво встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересую­щий насучасток ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) — плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про- или эукариоти там автономно репли-цироваться. На следующем этапе проводится отбор техклеток, кото­рые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных призна­ков,которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нассегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена илиучастка ДНК).                

При решении ряда научных и биотехнологических задач конст­руирование рекомбинантныхДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессияклонируемого гена.

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные молекулы.В первом случае 3'-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующийнас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью ферментатерминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью(например, поли (Т)). 3'-концы ли­нейной формы векторной ДНК тем же способомнаращиваются комп­лементарной ей гомополинуклеотидной последовательностью (тоесть по­ли (А)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплемен­тарногоспаривания искусственно полученных «липких» концов.

Во втором случае «липкие» концы создаются с помощью расщеп­лениямолекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) однойиз эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы характеризуютсяисключительно высокой специ­фичностью. Они «узнают» в ДНКпоследовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строгоопределенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров рестриктазывносят ограниченное число разрывов.

Третий способ представляет собой комбинацию двух первых, когда липкиеконцы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическимипоследовательностями (рис. 1).

Концы фрагментов ДНК можно превратить в «липкие», наращи­вая ихдвутяжевыми олигонуклеотидами («линкерами»), в состав кото­рых входитучасток узнавания рестрикта-

/>

Рисунок 1. Схема конструированиярекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли(G)- поли(С)-линкера.

зой. Обработкатакого фраг­мента данной рестриктазой делает его пригодным для встраивания ввекторную молекулу ДНК, расщепленную той же рестриктаэой. Часто в качестве«линкера» применяются полинуклеотидные фрагменты, ко­торые содержатспецифические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют«полилинкерами»).

После встраивания чужеродной ДНК в вектор их ковалентное сшивание осуществляетсяДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает однуфосфодиэфирную связь, она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo спомощью репарирующих систем клетки.

1.2.2. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ РНК

Получение рекомбинантных РНК обычно осуществляютметодами ферментативного или химического лигирования РНК. Кроме того, недавнопоявилась принципиально но­вая возможность встраивания сегмента РНК в заданноеположение других молекул РНК с помощью рибозимов.

Ковалентное сшивание отдельных сегментов РНК при получении рекомбинантныхмолекул, как правило, осуществляют с помощью Т4 РНК-лигазы. Т4 РНК-лигазазакоди­рована в геноме бактериофага Т4. Ее выделяют из клеток E.coli, зараженных этимфагом. Фермент сшивает друг с другом однотяжевые олиго- и полирибонуклеотиды.Для работы Т4 РНК-лигазы необходим источник энергии — аденозинтрифосфат. Нарис. 2 приведена схема ферментативного лигирования двух короткихолигонуклеотидов. Как видно из этой схемы, акцептором в реакции лигированияслужит пол­ностью дефосфорилированный, а донором — полностью фосфорилированныйпо концевым нуклеотидным остаткам олигонуклеотид. Это предотвращает возможностьсшивания однотипных олигонуклео­тидов.

Эффективность ферментативного лигирования достаточно длинных полирибонуклеотидовсильно варьирует и ее трудно предсказать исходя только из нуклеотидной последовательностисегментов РНК. Наилучшие результаты получены в тех случаях, когда сшиваемыеконцы полирибонуклеотидов были пространственно сближены за счет комплементарногосвязывания соседних с ними участков РНК.

Недавно было установлено, что протяженные сегменты РНК (длиной в 200-300остатков) могут быть с высоким выходом сшиты Т4 ДНК-лигазой. При этом«стыковка» сегментов осуществляется с по­мощьюолигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3'-концу одного сегмента и5'-концу другого.

Метод химиче­ского лигирования основан на активации концевой фосфатнойгруппы  одного  из  двух  сшиваемых  сегментов  РНК  водорастворимым карбодиимидом  или

/>

Рисунок 2. Схемасшивания двух олигорибонуклеотидов с помощью Т4 РНК-лигазы.

BrCN. В случае BrCN реакция про­текаеточень быстро и не сопровождается модификацией нуклеотид­ных остатков, хотя поддействием карбодиимидов фосфодиэфирная связь образуется с более высокимвыходом. Для того, чтобы обеспечить сближенность сшиваемых концевыхнуклеотидных остатков в фрагментах РНК, было предложено использоватьолигодезоксирибонуклеотиды, комп­лементарные обоим фрагментам в месте их стыка.

 Химическое лигирование РНК, как правило, проходит с существенно меньшимвыходом, чем ферментативное. Однако оно позволяет получать рекомбинантные РНК снеобычными типами межнуклеотидной связи (например, пирофосфатной) и необычныминуклеотидными остатками в месте стыка двух фрагментов.

Получение рекомбинантных РНК с помощью рибозимов основано на обратимостиреакции самосплайсинга (при отсутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов).Это предоставляет возможность для встраивания интронной РНК в заданный участокдругого сегмента РНК (рис. 3). Фрагмент РНК, в который производитсявстраивание, должен содержать нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотиднойпоследова­тельности 3'-концевого участка 5'-экзонного района 26S РНК и соот­ветственно комплементарную той нуклеотидной последовательностив интроне, которая отвечает за специфичность прямой реакции. Фраг­мент, вкоторый производится встраивание, берется в избытке.

В настоящее время описанная здесь цепь реакций может быть реализованатолько для интронной РНК, получаемой из предшест­венника 26S РНК тетрахимены.Однако можно думать, что конструи­рование новых рибозимов может существеннорасширить возможности этого подхода.

1.2.3. СТРАТЕГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ

Векторные молекулы в обязательном порядке содержатмаркерные гены, которые после переноса вектора в клетки-реципиенты сообщают имновые свойства. Это может быть устойчивость к антибиотику, которой дотрансформации клетки не обладали, или образование фермента, синтез которого вклетках-реципиентах не происходил. Благодаря таким вновь приобретеннымпризнакам клетки с векторными ДНК могут быть легко найдены в популяции исходныхклеток. Одновременно могут быть отобраны те клетки, которые содержат векторы совстроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК). Для этого встраиваниечужеродной ДНК в вектор производится таким образом, чтобы один из маркерныхпризнаков вектора нарушался. Так, например, если бактериальный вектор несетустойчивость к двум антибиотикам, то чужеродную ДНК встраивают  в  один

/>

Рисунок 3. Схемапрямого и обращенного процесса самосплайсинга.

из генов антибиотическойустойчивости. И тогда бактерии с рекомбинантной ДНК, в отличие от бактерий сисходным вектором, могут расти в присутствии только одного из антибиотиков.

 Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной ДНКнаряду с генами, сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам, фрагменталактозного оперона, обеспечивающего об­разование в клетках-реципиентахактивного фермента b-галактозидазы.Колонии клеток с таким признаком легко обнаруживаются при выращивании их натвердом агаре, содержащем в качестве субстрата b-галактозидазы5-бром-4-хлор-3-индолил-b-галактозид (X-gal), по­скольку его расщеплениеприводит к образованию бромхлориндола — красителя, окрашенного в голубой цвет.Если же в ген b-галактозидазы этоговектора встроена чужеродная ДНК таким образом, что этот ген оказался нарушенным,то трансформированные им клетки будут обра­зовывать бесцветные колонии. Само жеприсутствие рекомбинантного вектора в клетках может быть зафиксировано по их устойчивостик антибиотику.

На следующем этапе среди популяции клеток с рекомбинантными векторами необходимоотобрать индивидуальные клоны, содержа­щие только интересующие нас гены или ихфрагменты. Само собой разумеется, что это в принципе возможно только в томслучае, если в исходные клетки проникло в среднем по одной молекулерекомбинантной ДНК. Способ же отбора клонов в значительной степени зависит отприроды клонируемого гена.

По-видимому, самым простым является случай, когда клониру­емый генспособен комплементировать ауксотрофную мутацию в штамме-реципиенте. В этомслучае клетки высеваются на среду, ли­шенную вещества, необходимого для ростаданного штамма, и только клетки, содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном,способны расти на этой среде. Из  таких клонов получают гомогенную культуруклеток, которую используют для получения искомого сегмента ДНК, проделывая всеоперации в обратном порядке (то есть из клеток выделяют вектор, из неговычленяют необходимый фрагмент ДНК и так далее).

Гораздо чаще для отбора необходимых клонов приходится при­бегать к методуДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. Для этого необходимо располагать«зондами» (индивидуальными молекула­ми ДНК или РНК или ихфрагментами), комплементарными нуклеотидной последовательности клонируемогогена. Это могут быть специ­ально синтезированные олигодезоксирибонуклеотидыдлиной в 15-20 остатков, последовательность которых выбрана на основании полно­стьюили частично известной первичной структуры гена или закодиро­ванного в нембелка. Это могут быть кДНК, синтезированные на инди­видуальных РНК-копияхданного гена (как таковые или в виде отклонированных, то есть существенноумноженных в количестве фрагментов ДНК). Наконец, это могут быть сами индивидуальныеРНК, закодированные в данном гене. Ясно, что во всех случаях «зонды»должны нести радиоактивную метку (обычно 32Р) с достаточно высокойудельной активностью.

Если же индивидуальный «зонд» недоступен, то применяют методы,которые из большого числа рекомбинантов (106) позволяют выбратьсравнительно небольшую группу (около 102), включающую рекомбинант сискомым геном. Эта группа подразделяется на подгруп­пы (например, на 10) по 10рекомбинантов. Из каждой подгруппы выделяется ДНК, которую используют длясинтеза мРНК и последу­ющей трансляции ее с целью обнаружения соответствующегопродукта искомого гена.

Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе. Однако вслучае эукариотических генов мРНК часто перено­сят в ооциты лягушки (ксенопуса)с помощью техники микроинъек­ции, где она транслируется. Продукт трансляцииобычно обнаружива­ют с помощью антител.

Далее в подгруппе, где обнаружен искомый ген, тем же методом исследуетсякаждый клон.

При наличии зонда с чашки Петри, на которой выращены колонии клеток,делается отпечаток (реплика) на нитроцеллюлозном фильтре. Клеткам дают вырастина фильтре, затем их разрушают, подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтрпрогревают при 80°С, после чего ДНК необратимо с ним связывается. Фильтр отмыва­ютот примесей и обрабатывают радиоактивным «зондом» в условиях,оптимальных для ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. После удаления избытка«зонда» методом ауторадиографии определяют поло­жение клеточногоклона, содержащего участок ДНК с нуклеотидной последовательностью,комплементарной «зонду». Этот клон становит­ся затем источником клетокдля получения искомого гена или его фрагмента.

Для селекции клонов, несущих необходимый ген, достаточно широкоприменяются и иммунологические методы. Принцип отбора на первых этапах тот же,что и при использовании ДНК- и РНК-зондов. Далее с колоний с рекомбинантнымиДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки, на которой закрепленыантитела к продукту искомого гена. Положение клонов, вырабатывающих этот белок,опре­деляется также с помощью антител, но уже меченных радиоактивным йодом (125I).

1.2.4. РАЗНООБРАЗИЕ ВЕКТОРНЫХМОЛЕКУЛ

Под понятием «вектор» понимается молекула нуклеиновой кислоты,способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия вней сигналов репликации и транскрипции.

Векторные молекулы должны обладать следующими свой­ствами:

1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то естьбыть самостоятельным репликоном;

2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессиикоторых у клетки-реципиента появляются новые призна­ки, позволяющие отличитьтрансформированные клетки от исходных;

3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) дляразличных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов),но не в области, ответственной за их репликацию.

В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить надве группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2)специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов.Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтезбелковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержатпоследовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копийгенов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.

В качестве прокариотических векторов используютсяплазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусыживотных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и рядискусственно сконструированных векторов, способных реплицироваться как вбактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).

Плазмиды — это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот,которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторовполучено на основе природных плазмид ColE1, pMB1  иp15A. 

Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошоизученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способныпереходить из клетки в клетку, другие такой способно­стью не обладают. По рядупричин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространенияпотенциально опасного генети­ческого материала, подавляющее большинствобактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса.Многие при­родные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клетокк антибиотикам (продукты этих генов — ферменты, модифици­рующие илирасщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды приконструировании векторов вводятся дополнитель­ные гены, определяющиеустойчивость к другим антибиотикам.

На рис. 4 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli — pBR322.Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli — колициногенного фактора ColE1- и содер­жит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 (иpBR322 соответственно) состоит в том, что в присутствии ингибитора синтезабелка антибиотика хлорамфеникола (опосредо­ванно ингибирующего репликацию хозяйскойхромосомы) ее число в E.coliвозрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большиеколичества клонируемого гена. При конструирова­нии вектора pBR322 из исходныхплазмид был делегирован целый ряд «лишних» сайтов для рестриктаз.

В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированыплазмидные векторы для ряда дру­гих грамотрицательных бактерий (в том числетаких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter),грамположительных бактерий (Bacillus), низшихгрибов (дрожжи) и растений.

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов(до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуетсяполучить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общаядлина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторыдля этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов  для высших эукариотудалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофагаl.

Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созда­ны на базегеномов бактериофагов l и М13 E.coli. ДНК этих фаговсодержит протяженные области, которые можно делегировать или за­менить начужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструированиисемейства векторов на базе ДНК l фагаиз нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайтырестрикции из области, не сущест­венной для репликации ДНК, и оставлены такиесайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту жеобласть часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантнуюДНК от исходного вектора. Такие векторы широко использу­ются для получения«библиотек генов». Раз­меры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственновстраи­ваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидныхостатков, так как  рекомбинантный  фаго -

/>

Рисунок 4. Детальнаярестрикционная карта плазмиды pBR322.

вый геном,который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого l фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы.

Таких ограничений теоретически не существует для векторов,сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда вгеном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидныхостатков. Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длиначужеродной ДНК пре­вышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически же векторы,полу­ченные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования имутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.

Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фагаМ13, в которую встроены «полилинкерные» участки (пример такойконструкции показан на рис. 5). В фаговую частицу ДНК включается в видеоднотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированныйген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевыеформы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при опреде­лениинуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера  и дляолигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.

Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов,полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных — SV40, некоторыхаденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструированиеэтих векторов проводится по стандартной схеме: удаление «лишних»сайтов для рестриктаз, введе­ние маркерных генов в области ДНК, не существенныедля ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk)из HSV (вируса герпеса)), введение регуляторныхрайонов, повышающих уровень экспрессии ге­нов.

Удобными оказались так называемые «челночные векторы», спо­собныереплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают,сшивая друг с другом большие сегменты век­торов животных и бактерий (например,SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные зарепликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основныеоперации по конструированию век­тора в бактериальной клетке (что техническинамного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать дляклонирования генов в животной клетке.

/>

Рисунок 5.Рестрикционная карта вектора М13 mp8.

1.3. ВЫБОР СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННОГО
ГЕНА, СПОСОБНОЙ ОБЕСПЕЧИТЬ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД И
ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ПРОДУКТА

Полученные рекомбинантные молекулы переносятся вопределенные группы клеток, которые должны обеспечить экспрессию этих генов, тоесть синтез соответствующих белков в количествах, экономически рентабельных посравнению с обычной технологией их производства.

Обычно для данной цели используют бактериальные или дрожжевые культуры клеток,а также системы экспрессии на основе эукариотических клеток.

Из бактериальных клеток наиболее изученной в молекулярно-генетическом отношенииявляется грамотрицательная бактерия Escherichia coli, поэтому для нееможно с наибольшей определенностью планировать генноинженерные конструкции.Однако E. coliслабо освоена промышленностью. Кроме того, она относится к условно-патогеннымдля человека микроорганизмам, что может создать трудности при получении на ееоснове фармацевтических препаратов.

Отмеченные недостатки E. coli легко преодолеваются приконструировании методами генной инженерии штаммов-продуцентов на основе клетокBacillus subtilis. Данная почвенная бактерия безопасна длячеловека и животных и прекрасно освоена микробиологической промышленностью.Бактерия B. subtilis по степени изученности следует заE. coli. Важное отличие ееот E. coli — способность эффективно секретировать во внешнюю средуцелый ряд белков, поэтому особенно интересны работы по созданиюштаммов-продуцентов B. subtilis,секретирующих чужеродные белки из клеток. Однако данная бактерия имеет своинедостатки: рекомбинантные плазмиды в B. subtilis характеризуются нестабильностью,выражающейся в перестройках и делециях ДНК; бациллы секретируют в культуральнуюсреду большое количество протеаз, что существенно усложняет вопросмаксимализации генноинженерного получения целевого белка на основебацилл-продуцентов.

Среди эукариотических микроорганизмов наиболее изученным является низшийэукариот Saccharomyces cerevisiae. Одно из преимуществ S.cerevisiae какэкспериментальной системы — простота и надежность ее генетического анализа. Вклетках дрожжей имеется ферментативная система гликозилирования белков, котораяобеспечивает возможность синтеза в них полноценных белков высших эукариот. Аналогичныхсистем процессинга белков в бактериальных клетках нет. Многие штаммы дрожжейосвоены микробиологической промышленностью. Доказана их безвредность длячеловека и животных. Именно на S. cerevisiae создан первыйштамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита Б, позволивший получитьи испытать вакцину против данного вирусного заболевания человека.

С появлением генной инженерии внимание многих исследователей привлекла системакультивируемых клеток животных. Особый интерес к культурам клеток животных сталпроявляться после обнаружения того, что часть эукариотических генов раздробленаи лишь в системе клеток высших эукариот можно достичь правильной экспрессиитаких генов. Кроме того, многие белки животных и их вирусов синтезируютсяпервоначально в виде более высокомолекулярных  предшественников, которые врезультате специфического протеолитического процессинга переходят в такназываемую зрелую форму. Такой процессинг данных белков, по-видимому, можноожидать лишь в системе клеток животных. Все это убедительно доказывает важностьразработки экспрессирующей системы на основе клеток животных.

Для обеспечения наиболее эффективной экспрессии клонированных генов в векторныемолекулы встраивают определенные фрагменты ДНК, позволяющие увеличить выходчужеродного белка. Так, для достижения более высокого уровня экспрессии гена HBsAg в клетках E. coli были использованы различныепо силе промоторы (промоторы генов cat, kan,bla,trp и тандемно расположенных промоторов геновkan иtrp). Уровнисинтеза последовательностейHВsAg(нативного и в составе химерных белков) составляли в зависимости отиспользуемых конструкций векторов от 100 до 100000 молекул на клетку.

1.4. СОЗДАНИЕ ДОСТАТОЧНО УДОБНЫХ И ПО ВОЗМОЖНОСТИ

УНИВЕРСАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЦЕЛЕВОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В

КЛЕТКИ И ТКАНИ ОРГАНИЗМА

Важным моментом при конструировании ДНК-вакцинявляется проблема целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и защитывводимых ДНК от действия нуклеаз крови. В результате экспериментальной работыбыли созданы разнообразные конструкции, позволяющие доставлять целевые гены вклетки-мишени.

Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора длядоставки генов в такие клетки, как лимфоциты и кераноциты. В качествемодельного был использован ген, кодирующий гибридный белок: фактор некрозаопухолей-альфа — интерферон-гамма. В центре вектора находится интактнаяплазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаютсяантитела к клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителамиприменяется для связи компонентов (положительно заряженный спермидинобеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК). Описанный молекулярныйвектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени, сводя доминимума их попадание в другие виды клеток, защищать доставляемые гены отнуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплексспермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки.

В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клеткикостного мозга гена, кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий  факторчеловека (чГ-КСФ). Данный белок относится к семейству гемопоэтических факторовроста и является одним из физиологических регуляторов, специфически ивысокоэффективно стимулирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтическихпредшественников нейтрофилов. чГ-КСФ увеличивает продолжительность жизни клетоккостного мозга, усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов.Созданный вектор представляет собой многослойную конструкцию. «Центральнымядром» конструкции является плазмида pGGF8,содержащая ген чГ-КСФ. Ее окружает полисахаридная оболочка, которая состоит изполиглюкина и спермидина. Внешний белковый слой содержит смесь сывороточногоальбумина и белка доставки — трансферина.  Эффективность описанной векторноймодели была доказана опытным путем.

Итак, при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин немаловажноезначение имеет создание специального вектора-носителя, обеспечивающего адреснуюдоставку генов и их защиту от действия нуклеаз крови.

2. ВАКЦИНА ПРОТИВ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК,

ИЗГОТОВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Возбудителем лейкемии кошек является ретровирустипа С. Вирус лейкемии кошек (FeLV) имеет в качествегенетического материала молекулу РНК. Заболеваемость и смертность средидомашних кошек в Швейцарии довольно высока. Вакцина против  FeLV,изготовленная традиционным путем, была разработана несколько лет тому назад инаходится в продаже в Швейцарии. Высокая цена современных вакцин и отсутствиеуверенности в отношении длительности эффекта и надежности вакцины вызвалинеобходимость создания вакцины с помощью генной инженерии.

При конструировании рекомбинантной вакциныоболочечный протеин вируса (env-ген) клонировалсяв пивных дрожжах (Saccharomycescerevisiae). Env-генвначале лигировался с промотором дрожжей (пируваткиназный промотор), а затемклонировался в так называемом "Shuttle"-векторе.Вектор "Shuttle" (челночный вектор)может размножаться как в бактерии E. coli, так и в пивных дрожжах S.cerevisiae.Он содержит с одной сторонырепликационные оригины как для дрожжей, так и для E.coli, а с другой стороны селекционный маркердля дрожжей (leu2 ген) и для E.coli (резистентность кампицилину). Из литра дрожжевой культуры выделяют множество миллиграмм env-протеина и затем тестируют в опыте по вакцинации.Результат вселяет надежду: 10 кошек были иммунизированы env-протеином,причем 4 дали ответ антителами. Через 2 недели провели заражениеFeLV. Теперь все животные давали ответ антителами.

Таким образом, полученная вакцина оказаласьэффективным средством для борьбы с данным заболеванием.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.    ГренЭ. Я., Пумпен П. П. Рекомбинантные вирусные капсиды — новое поколениеиммуногенных белков и вакцин // Журнал ВХО. — 1988. — т. II,№5.  — с. 531-536.

2.    ДмитриевБ. А. Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин // Иммунология. — 1986. — №1. — с. 24-29.

3.     ЛебедевЛ. Р., Сизов А. А., Масычева В. И., Карпенко Л. И., Рязанкин И. А. Молекулярныйвектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология. -  2001. — №1. — с.3-12.

4.    МертвецовН. П., Беклемишев А. Б., Савич И. М. Современные подходы к конструированию молекулярныхвакцин. — Новосибирск: Наука, 1987, 210 с.

5.    СизовА. А., Лебедев Л. Р., Масычева В. И., Кашперова Т. А., Одегов А. М. Разработкавирус-подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспорта гена чГ-КСФв клетки костного мозга in vivo // Биотехнология. — 2001. — №1. — с. 13-18.

6.    ШабароваЗ. А., Богданов А. А., Золотухин А. С. Химические основы генетическойинженерии. — М.: Изд-во МГУ, 1994, 224 с.

7.    ЩелкуновС. Н. Клонирование генов. — Новосибирск: Наука, 1986, 232 с.

8.    ЮровГ. К., Народицкий Б. С., Юров К. П. Конструирование и использование ДНК-вакцин// Ветеринария. — 1998. — №12. — с. 25-27.

9.    Hubscher U.Генная инженерия и ветеринария. Вакцины, изготовленные с помощью генной инженерии,и анализ высоковариабельных участков ДНК. -Schweiz. Arch. Tierheilk., 1987, 129, №11,553-564.