Реферат: Настоящее и будущее биосенсоров

МИНИСТЕРСТВООБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

 

Факультет химико-биолого-географический

Кафедра    неорганической и аналитической химии

Курсовая работа

 

“Настоящее и будущее биосенсоров”

Выполнил: студент Х-Б-Г факультета Курс: 2 Проверил: Группа: 26(2) «_____»______________2002г. Фамилия: Лапшин С.В.

Тверь — 2002г.

/>Содержание

Введение… 3

Что такое биосенсор… 3

Как работает биосенсор… 5

Где применяют биосенсоры… 6

Биосенсоры на основе другихбиоматериалов… 7

Проблемы и перспективы развития… 9

Литература… 11

/>/>Введение

Биологическиеметоды позволяют судить о присутствии какого-либо вещества или егоколичественном содержании по характеру и величине его воздействия на определенныйорганизм, взятый как индикаторный. Аналитическим сигналом при этом являетсяизменение состояния жизнедеятельности этого организма, то есть его реакция нараздражитель, которым, например, могут быть токсиканты среды обитания иликакие-либо другие биологически активные соединения, вызывающие нарушениежизненных функций индикаторного организма или его гибель. К биологическимметодам относят и биохимические методы, в частности ферментативные, а такжеразличные методики, например индикаторные трубки на основе ферментов и другихбиологических материалов. Интересно, что механизм получения информации осоставе какого-либо объекта с помощью этих методов и устройств моделируетпроцесс в живой природе, что особенно важно при анализе объектов биологическогопроисхождения.

Известно, чтоферменты — это биологические катализаторы, обладающие ярко выраженнойспособностью избирательно катализировать многие химические превращения как вживой клетке, так и вне организма. Замечательные свойства ферментов давнопривлекали внимание исследователей, в том числе и аналитиков, но практическомуприменению ферментов, например для аналитических целей, препятствовали преждевсего малая доступность чистых ферментов, неустойчивость во времени ихрастворов, препаратов при хранении и воздействии на них различных факторов(тепловых, химических), невозможность многократного использования одной порциифермента из-за сложности отделения его от других компонентов раствора, высокаястоимость очищенных препаратов. Однако выход из положения вскоре был найден, ипоявилась возможность использования каталитических свойств ферментов вне ихсвязи с живым организмом и возможность сохранения этой способности в течениедлительного времени практически без изменения. Достижения в этой областибиохимии и энзимологии дали начало развитию нового направления аналитическойхимии — безреагентных методов анализа, основанных на использовании различныхбиохимических сенсоров.

/>/>Чтотакое биосенсор

Под термином«биосенсор» следует понимать устройство, в котором чувствительныйслой, содержащий биологический материал: ферменты, ткани, бактерии, дрожжи,антигены / антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК, непосредственнореагирующий на присутствие определяемого компонента, генерирует сигнал,функционально связанный с концентрацией этого компонента. Конструктивнобиосенсор представляет собой комбинированное устройство, состоящее из двухпреобразователей, или трансдьюсеров, — биохимического и физического,находящихся в тесном контакте друг с другом. Биохимический преобразователь, илибиотрансдьюсер, выполняет функцию биологического элемента распознавания,преобразуя определяемый компонент, а точнее, информацию о химических связях вфизическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь этосвойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры. В данном случаереализуется принципиально новый способ получения информации о химическомсоставе раствора. Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствамипозволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной посоставу смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связанным сиспользованием других реагентов, концентрированием и т. д. (отсюда и название — безреагентные методы анализа).

Существуетбольшое разнообразие физических трансдьюсеров: электрохимические,спектроскопические, термические, пьезоэлектрические, трансдьюсеры наповерхностных акустических волнах и т.п. В настоящее время наибольшеераспространение получили электрохимические преобразователи. Одни из нихгенерируют потенциал на специальном электроде, на поверхность которого нанесенслой биоматериала, другие генерируют электрический ток реакции продуктапревращения определяемого вещества на поверхности электрода, вызванногобиоматериалом. Другими словами, существуют потенцио- и амперометрическиебиосенсоры. Если физический преобразователь использует изменениесветопоглощения в области биослоя, то такой биосенсор называется, например,оптоволоконным, поскольку измеряемый сигнал будет передаваться измерительномуприбору по оптическому волокну. Соответствующий физический преобразователь поаналогии с электродом называют оптродом. По названию преобразователя можносделать вывод о характере физического свойства, которое измеряется аппаратно,причем, как правило, при таком измерении используется микропроцессорнаятехника, позволяющая сделать устройство достаточно компактным.

Первоеупоминание об аналитических устройствах на основе ферментов илиферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х годахнашего столетия. Затем в обиход вошло понятие «биосенсор» или«биочип». Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокиепричины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами внауке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально, таким образом,биосенсоры сопоставлены с датчиками живого организма — биорецепторами,способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды,в электрические.

/>/>Какработает биосенсор

Принцип работыбиосенсора достаточно прост. Определяемое вещество диффундирует черезполупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, в котором и протекаетферментативная реакция. Поскольку в данном случае продукт ферментативнойреакции определяется с помощью электрода, на поверхности которого закрепленфермент, то такое устройство еще называют ферментным электродом. Таким образом,определения «биосенсор» и «ферментный электрод» в данномслучае синонимы.

Следуетотметить, что характер ферментативной реакции зависит от природы фермента, типаего каталитического действия. Среди ферментов можно выделить оксидоредуктазы,осуществляющие реакции окисления и восстановления, гидролазы, катализирующиегидролиз, трансферазы, вызывающие перенос ацильных, гликозидных и т.п. остаткови т.д. Многие ферменты сейчас доступны, их чистые препараты включены в каталогиряда фирм-производителей. Важно отметить, что при конструировании биосенсораувеличение продолжительности действия фермента становится основной задачей.Дело в том, что нативный фермент сохраняет свои свойства лишь в течениеотносительно короткого времени. Поэтому была разработана операция такназываемой иммобилизации фермента. В ходе иммобилизации с помощью специальныхреагентов фермент «закрепляют» либо на поверхности адсорбентов,например силикагеля, угля или целлюлозы, либо вводят в пленку пористогополимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей,«пришивают» к какой-либо подложке. При этом фермент закрепляется,перестает быть подвижным, не вымывается из биослоя, а его каталитическое действиесохраняется… Как видно, при иммобилизации ферментов используют разнообразныеспособы их закрепления, в том числе и комбинированные. Биосенсоры могут бытьсконструированы и по так называемой объемной технологии, при которойиндивидуальные компоненты, составляют как бы единый физический ансамбль. Хотятакие биосенсоры в настоящее время и применяются на практике, они имеютнедостатки, есть трудности и при их изготовлении. В самом деле, послойноепокрытие электрода или какого-либо твердого преобразователя мембраной должнобыть воспроизводимо. Соответствующая технология формирования поверхности должнадопускать возможность изготовления достаточно миниатюрного электрода. Крометого, биосенсоры со сравнительно толстыми мембранами дают в итоге большее времяотклика, имеются сложности и при их градуировке. Успехи в области развитиясредств микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций биосенсоров кновым решениям. Оказалось перспективным использовать так называемую планарнуютехнологию (фотолитографию, полупроводниковую технику покрытий и т. д.), покоторой можно изготовить так называемый биочип, объединяющий сенсорную систему,трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор для измеренияаналитического сигнала и расчета результатов анализа. Хотя такие биочипы могуттиражироваться, основной проблемой в данном случае будет являтьсявоспроизводимость состояния, то есть микроструктуры поверхности с нанесеннымслоем биологически активного фермента. Трудной задачей представляется в данномслучае и оптимизация такой структуры в отличие от объемной технологии,реализованной присутствием в конструкции сенсорной части несколькихмолекулярных слоев. Тем не менее «молекулярный дизайн» приконструировании биосенсоров будущего может составить реальную конкуренциюобъемному их варианту.

/>/>Гдеприменяют биосенсоры

По-видимому,самым распространенным в настоящее время является амперометрический биосенсорна основе иммобилизованной глюкозоксидазы для определения сахара в крови.Исторически этот биосенсор является самым «древним». В настоящеевремя для определения глюкозы создано наибольшее число различных биосенсоров,что связано с необходимостью контроля за содержанием сахара в биологическихжидкостях, например в крови, при диагностировании и лечении некоторыхзаболеваний, прежде всего диабета. Схема функционирования биосенсора на глюкозув принципе типична и для других амперометрических биосенсоров с аналогичнымтрансдьюсером. Ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямопропорционален концентрации кислорода. В присутствии субстрата (например,глюкозы в крови, взятой для анализа) ферментативная реакция понижаетконцентрацию O2.Таким образом, ток восстановления кислородауменьшается пропорционально концентрации субстрата

Преимуществоданного типа биосенсора состоит прежде всего в его высокой селективности.Избирательность подобных биосенсоров определяется высокой специфичностьюглюкозоксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуюткомпоненты ферментативного процесса. В целом класс ферментов — оксидаз являетсявысокоспецифичным по отношению к определяемым субстратам. Системы же на основенебиологического преобразователя, напротив, не столь селективны, как этого быхотелось, что обусловлено рядом причин. Тем не менее имеются ограничения и поприменению данной конструкции биосенсора, обусловленные влиянием кислорода идругих посторонних веществ, способных проникать через биослой (точнее, черезмембрану), а потому задача совершенствования конструкций биосенсоров на глюкозупредставляется весьма актуальной.

Один извозможных путей такого усовершенствования заключается в следующем. Еслиизменить полярность включения электрода-трансдьюсера в глюкозном биосенсоре напротивоположную, то есть платиновый катод сделать анодом, то при потенциале +0,6В он становится совершенно нечувствительным к кислороду, но зато даетотклик на пероксид водорода, который при данном значении потенциала окисляетсядо воды. Чувствительность такого электрода к пероксиду водорода оказаласьпривлекательной, а поскольку вода образуется как продукт ферментативнойреакции, по его содержанию можно сделать вывод о концентрации, например глюкозыв различных объектах. Другой способ улучшения селективности биосенсоров иустранения помех от посторонних примесей состоит в использовании различныхмембран — пленок, предотвращающих их попадание непосредственно наэлектрод-преобразователь. При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защитыот примесей, а внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. Однаконеобходимо отметить, что с помощью специальных приемов, называемых химическоймодификацией, можно до такой степени изменить свойства поверхности электрода,что он будет «глухим» к большинству примесей и, напротив,чувствительным к компонентам ферментативной реакции.

Биосенсоры,основанные на кислородном электроде как физическом трансдьюсере, позволяютопределять разнообразные субстраты ферментов: кроме глюкозы — лактаты,L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты, то есть анионы соответствующихкарбоновых кислот. В литературе описаны другие биосенсоры подобного типа, рядкоторых применяется на практике.

С помощьюбиосенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой определеннойконцентрации субстрата оценивать активность собственно фермента по величинеизмеряемого сигнала    ( потенциала, тока и т. д.). Из описания работы ферментаследует, что измеряемый сигнал зависит не только от концентрации субстрата, нои от каталитической активности биологического преобразователя, то естьфермента. Такое использование биосенсоров позволяет измерить активностьбольшого числа ферментов, например в крови. Оценка активности ферментов,связанных с сердечной деятельностью, таких, как аспартамаминотрансфераза,креатинкиназа, позволяет в клинических условиях оценивать глубину инфаркта миокарда.Измерения активности фермента амилазы используются в педиатрии.

/>/>Биосенсорына основе других биоматериалов

Многие ферментыдороги и быстро теряют свою активность, использование выполненных на их основебиосенсоров не может быть экономически целесообразным. Поэтому применениебактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения болеепредпочтительно, поскольку в данном случае отпадает необходимость впредварительном получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам такихбиосенсоров можно отнести низкую селективность определения вследствие того, чтоклетки живых организмов фактически являются источником самых разнообразныхферментов. Помимо этого время отклика биосенсоров на основе тканей имикроорганизмов может быть достаточно большим, что также уменьшает ихпрактическую ценность. Тем не менее в последнее время наблюдается повышенныйинтерес к разработке конструкций электродов, содержащих не сами ферменты вочищенном виде, а их первозданные источники — биологические материалы. Так,было установлено, что тканевые срезы в биосенсорах могут выполнять функциюисточников каталитической активности. Например, создан биосенсор нааскорбиновую кислоту, состоящий из платинового электрода и пластины кожурыогурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента втакой природной матрице достаточна для проведения 50-80 определенийаскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластиныбиоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-номглицерине.

Аналогичныйподход использовали при создании конструкции биосенсора на допамин — важнейшийбиогенный амин, участвующий в регуляции деятельности мозга. В данном биосенсореткань плода банана была иммобилизована на поверхности кислородного электрода. Врассмотренных случаях биоматериалы создают «естественное окружение»для ферментов, способствующее стабилизации их активности. Тканевые материалыдостаточно долго сохраняют высокую специфичность, что очень важно длябиосенсора, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях быстро разрушаются.Известны биосенсоры, в которых использован цельный фрагмент ткани печени быка,являющийся носителем фермента каталазы и иммобилизованный на кислородномэлектроде. Ферментативное действие каталазы, проявляющееся в катализе реакцииразложения пероксида водорода, используют в этом случае для созданиясоответствующего электрода. Разработан биосенсор на основе кожуры кабачка илиогурца и кислородного электрода для определения L-аскорбиновой кислоты вофруктовых соках, функционирующий подобно аналогичному типу электрода, ужерассмотренного выше. Тем не менее, несмотря на успехи в развитии биосенсоров наоснове биологических материалов, надежность их функционирования все ещеостается спорной. Еще один пример конструкции биосенсорного устройстваотносится к ферментному электроду на основе микроорганизмов — дрожжей,помещаемых между двумя пористыми мембранами. Биосенсор на основеиммобилизованных дрожжей и кислородного электрода позволяет определять этанол иметанол, например в промышленных стоках.

Интереспредставляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране микроорганизмов,служащих элементом так называемого микробного сенсора. В качестве примера такихустройств можно упомянуть амперометрический сенсор на аммиак (в сточных водах)на основе иммобилизованных нитрифицирующих бактерий и кислородного электрода.Такой биосенсор полезен при решении вопросов охраны окружающей среды, и вчастности при контроле степени очистки промышленных стоков.

Можно отметитьтакже использование биосенсоров на основе гидролаз — ферментов, являющихсякатализаторами гидролитического расщепления субстратов. Эти биосенсорыпредназначаются, как правило, для эколого-аналитического контроля остаточныхколичеств пестицидов класса фосфорорганических соединений, а также дляопределения некоторых ОВ. Если при гидролизе какого-либо субстрата ферментомкласса гидролаз образуется электрохимически активное соединение, то,контролируя содержание последнего, можно контролировать ферментативную реакциютак же, как в предыдущих случаях. Однако в присутствии веществ, являющихсяингибиторами, активность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу,регистрируемому электродом. Интересно отметить высокую чувствительность такогоопределения: эффект изменения активности фермента доступен для измерения ужепри действии ультраследовых количеств ингибитора — на уровне пико- и фемтограмм

/>/>Проблемыи перспективы развития

Концепцияраспознавания определяемого вещества с помощью иммобилизованного биоматериала оказаласьплодотворной. В итоге исследователи приобрели новое средство, позволяющеебыстро получить достоверную информацию о состоянии окружающей среды и здоровьячеловека. Некоторые биосенсоры уже получают распространение для индивидуальногоиспользования в домашних аптечках (чаще всего для определения сахара в крови).Интерес к биосенсорам непрерывно растет. В 1996 году состоялись четыре крупныемеждународные конференции по биосенсорам.

Если иметь ввиду все разнообразие ферментов, присутствующих и действующих в живом организмеи являющихся потенциальными биологическими преобразователями, то следуетотметить, что существующее сегодня число конструкций биосенсоров может бытьувеличено в десятки и даже сотни раз. Биосенсоры получают распространение вбиотехнологии. Хотя здесь и встречаются трудности, связанные с невысокойтермической устойчивостью предложенных устройств, приводящей к дезактивациибиослоя, есть основания полагать, что данный недостаток будет в скором временипреодолен. Так, полагают, что для увеличения срока службы биосенсоров вобозначенных выше условиях можно использовать ферменты, выделенные изтермофильных бактерий и одноклеточных водорослей — микроорганизмов, устойчивыхк действию высоких температур. Определенные трудности представляют собой такжепроблемы градуировки биосенсоров и надежности их показаний. Для улучшенияпоследнего показателя, в частности, предлагается использовать мультисенсорнуюсистему, состоящую из ряда биочипов. Для получения определенной«емкости» надежных данных производится расчет необходимого числатаких датчиков. Однако в целом так называемые метрологические характеристикибиосенсоров вполне приемлемы. Относительное стандартное отклонение определяемойконцентрации не выше 10-12 %, притом что нижняя граница определяемых содержанийдостигает 10-15 моль/л. Некоторые биосенсоры работают по принципу да-нет, чтовполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультрамалых количестввысокотоксичных веществ в объектах окружающей среды. Если определяемыекомпоненты находятся в сложной смеси или матрице или же близки по своимсвойствам, то при анализе используют хроматографические методы разделения.Контроль за разделением осуществляют с помощью системы детекторов на основебиосенсоров. И здесь получены поразительные результаты: разделяют иколичественно определяют оптические активные изомеры, различные сахара(лактозу, фруктозу, глюкозу и т.д.), сложные по структуре биологически активныесоединения и т.п.

Вот один изнедавних примеров разработки биосенсоров, основанных на использованииприродного хеморецептора. Хеморецептор, извлеченный из чувствительных антенн(органелл) голубого морского краба, был прикреплен к ультрамикроэлектроду,измеряющему потенциал. В результате был изготовлен новый типпотенциометрического детектора, чрезвычайно быстро реагирующего на ничтожныеизменения состава среды, в которую он погружен. Сам голубой краб оченьчувствителен к следам тяжелых металлов и живет только в чистейшей морской воде.

На очередисоздание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволитсоздать «искусственные органы» обоняния и вкуса, а также применитьуказанные разработки для возможно более точной и информативной диагностики рядазаболеваний. Несомненно, что в ближайшем будущем в этой смежной областибиологии и химии следует ожидать новых открытий.

/>/>Литература

1.   Биосенсоры:основы и приложения / Под ред. Э. Тернера и др. М.: Мир, 1992. 614 с.

2.   Будников Г.К.,Майстренко В.Н., Муринов Ю.И. Вольтамперометрия с модифицированными иультрамикроэлектродами. М.: Наука, 1994. 239 с.

3.   Будников Г.К.,Медянцева Э.П., Бабкина С.С. // Успехи химии. 1991. Т. 60. С. 881.