Реферат: Стафилококки. Выявление резистентности к метициллину и другим b-лактамным антибиотикам методом скрининга

Кафедра клинической фармакологии и антимикробнойхимиотерапии Смоленской государственной медицинской академии

Контактныйадрес: Дехнич Андрей Владимирович

214019,Смоленск, а/я 5, Факс: (0812)61-12-94

andrei@microbiology.ru

УДК615.33.015.8.07

Выявление резистентности к метициллину и другим b-лактамным антибиотикам методомскрининга

С момента появления в 70-х годах метициллинорезистентныестафилококки и прежде всего метициллинорезистентныештаммы Staphylococcus aureus(MRSA) являются одними из ведущих возбудителей нозокомиальныхинфекций. Частота MRSA в структуре стафилококковых инфекций в последние годырезко возросла во всем мире, например, в США с 2% в 1975 г. до 35% в 1996 г.

Резистентностьстафилококков к оксациллину (метициллину) можетбыть обусловлена тремя основными механизмами:

q<span Times New Roman""> 

продукцией дополнительногопенициллинсвязывающего белка (ПСБ) – ПСБ-2а (фермента, участвующего в синтезеклеточной стенки), кодируемого хромосомальным геном mecА – классическая, или истинная резистентностьк метициллину (оксациллину);

q<span Times New Roman""> 

инактивациювследствие гиперпродукции бета лактамаз;

q<span Times New Roman""> 

модификацию нормальных ПСБ.

С клинической точки зрения, важно дифференцироватьштаммы с классической (mecА-обусловленной) резистентностью от штаммов с двумя другими редковстречающимися механизмами резистентности,обусловливающими низкий или пограничный уровень устойчивости. Это связано стем, что при инфекциях, вызванных штаммами с mecA-обусловленной резистентностью, терапия бета-лактамнымиантибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами, карбапенемами) будет неэффективна.

Кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиковза исключением гликопептидов (ванкомицин,тейкопланин). Фенотипические характеристики, которыемогут помочь дифференцировать три перечисленных механизма резистентности,изложены в таблице.

ТИПЫРЕЗИСТЕНТНОСТИ К МЕТИЦИЛЛИНУ(ОКСАЦИЛЛИНУ) У СТАФИЛОКОККОВ

Штаммы с классическим типом резистентностимогут в свою очередь быть гомо — или гетерогенными потипу экспрессии устойчивости. При гомогенном типе экспрессии практически всемикробные клетки проявляют резистентность встандартных in vitroтестах, в то время как при гетерогенном типе только небольшая часть клетокпроявляет резистентность фенотипически.Нередко только 1 из 10–100 млн клеток в популяции сналичием гена mecА экспрессируетрезистентность, что обусловливает получениепограничных результатов при определении чувствительности к оксациллину(МПК – 2–8 мг/л). Резистентность, обусловленная гиперпродукцией b-лактамаз и мутацией нормальных ПСБ, такжеприводит к получению пограничных значений МПК. Однако резистентностьк оксациллину, обусловленная гиперпродукциейb-лактамаз, легко отличается от классической резистентностипо ее обратимости при использовании ингибиторов b-лактамаз.

В отличие от штаммов с классической резистентностью гиперпродуцентыb-лактамаз и штаммы с мутациями нормальных ПСБ обычно не имеют множественной резистентности к другим антибиотикам.

Наличие классической резистентностинаиболее легко определить методом скрининга, так как рост микробных клеток снеклассическими типами резистентности обычно ингибируются.

Для определения чувствительности используется оксациллин ввиду его более высокой стабильности прихранении по сравнению с метициллином.

ПРИНЦИП

Для идентификации резистентностик оксациллину (метициллину)у стафилококков необходимо соблюдение следующих условий:

q<span Times New Roman""> 

NaCl в агар с оксациллином (pH 7,2–7,4, так какпри более низком pH увеличивается числоложноотрицательных результатов);

q<span Times New Roman""> 

температура инкубации 35oС;

q<span Times New Roman""> 

длительность инкубации 24 чдля S.aureus и 48 ч – для коагулазоотрицательныхстафилококков;

q<span Times New Roman""> 

стандартизированное числомикроорганизмов.

МИКРООРГАНИЗМ

Чистаякультура Staphylococcus spp.,инкубированная в течение 18–24 ч на кровяном агаре.

МАТЕРИАЛЫ

АгарМюллера–Хинтон с добавлением 4% NaCl (4 г на 100 мл среды) и 6 мг/л оксациллина (0,6 мг на 100 мл среды). Агар Мюллера–Хинтон хранится при температуре 2–8oС, готовится согласно прописи на этикетке, 4% NaCl добавляется до автоклавирования. Субстанция оксациллина с известной активностью предварительно растворяется в стерильной дистиллированной воде (расчет концентрации оксациллина проводят с учетом его активности) и добавляется в охлажденный на водяной бане до 48 –50oС агар Мюллера –Хинтон. Приготовленный агар разливается по чашкам с толщиной слоя 3–4 мм (на чашку диаметром 100 мм – 25 мл). Готовые чашки со средой хранятся в пластиковых пакетах при температуре 4 –8oС не более 5 сут. Для контроля роста необходимо также приготовить чашки с агаром, содержащим 4% NaCl, но без антибиотика. Кровяной агар с чистой культурой стафилококка, инкубированной в течение 18 –24 ч. Стерильный физиологический раствор. Стандарт мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Стерильные тампоны или микропипетка (10 мкл). Термостат с температурой инкубирования 35oС.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Исследование проводят при обязательном контролероста испытуемых культур на агаре Мюллера–Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).

Контрольные штаммы:

S.aureusATCC 38591 – резистентный;

S.aureusATCC 29213 –чувствительный.

ПОСТАНОВКАТЕСТА

Приготовление инокулюма.Бактериальную взвесь стафилококка готовят из нескольких колоний с одинаковойморфологией на стерильном физиологическом растворе (3 мл) и доводят до мутности0,5 по Мак-Фарланду (1,5·108 КОЕ/мл).

Инокуляция.Метод I (микропипеткой):

приготовить разведение 1:100 стандартного инокулюма 0,5 по Мак-Фарланду для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5·106 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физиологического раствора); с помощью микропипетки нанести каплю (10 мкл) разведенной стандартной суспензии на поверхность агара с оксацил лином.

 

МетодII (с помощью тампона ):

погрузить стерильный ватный тампон в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду), затем отжать избыток влаги о стенку пробирки; коснуться тампоном поверхности агара с оксациллином.

ИНКУБАЦИЯ. Штаммы S.aureusинкубируются при температуре 35oС в течение полных 24 ч, а коагулаза(–)стафилококков – в течение 48 ч.

Примечание. Среда АГВ не может быть рекомендованадля постановки теста в связи с высокой частотой ложноположительных результатов.

УЧЕТРЕЗУЛЬТАТА

Интерпретация:

q<span Times New Roman""> 

появление видимого ростаболее 1 колонии на месте нанесения культуры означает устойчивость данногоштамма к оксациллину (метициллину);

q<span Times New Roman""> 

при отсутствии роста наместе нанесения культуры исследуемый штамм учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).

q<span Times New Roman""> 

при сомнительныхрезультатах, а также для штаммов, выделенных у больных с клиническинеэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провестиразвернутое исследование с определением МПК к оксациллинуи гена mecA.

Представление результата:

q<span Times New Roman""> 

S.aureusили коагулаза(–)стафилококк (S.epidermidis), чувствительный к метициллину (оксациллину);

q<span Times New Roman""> 

S.aureusили коагулаза(–)стафилококк (S.epidermidis), резистентный к метициллину (MRSA или MRSE).

Метициллино (оксациллино) резистентные стафилококки должны расцениватьсякак резистентные ко всем b-лактамам – пенициллинам, цефалоспоринам,карбапенемам, комбинациям пенициллинов с ингибиторамиb-лактамаз. Кроме того, среди метициллинорезистентныхстафилококков очень часто наблюдается ассоциированная резистентностьк другим антибиотикам – аминогликозидам, макролидам, хинолонам,тетрациклинам.

ОГРАНИЧЕНИЯМЕТОДА

Скрининг на агаре с оксациллином предназначен для фенотипического определения штаммов, имеющих ген mecA. Однако штаммы с другими типами резистентности иногда могут давать ложноположительный результат. Метод скрининга для выявления резистентности к оксациллину (метициллину) менее надежен у коагулаза(–) стафилококков, чем у S.aureus.

Примечание.Оксациллин в сравнении с метициллиномменее стабилен к действию стафилококковых b-лактамаз, что может привести кполучению большего числа ложноположительных результатов, чем при использовании метициллина. В то же время метициллинв сравнении с оксациллином значительно менее стабиленпри хранении, что и ограничивает его применение.

ВАНКОМИЦИНОРЕЗИСТЕНТНЫЙStaphylococcus aureus

Овозможности появления ванкомицинорезистентных штаммовS.aureus стали задумываться около 10 лет назад после сообще ний о появлении резистентности к ванкомицину уэнтерококков.

Первоесообщение о выделении метициллинорезистентного S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину (МПК 8 мг/л) из клинического материалапоявилось в 1996 г.

Несмотряна значение МПК к ванкомицину, соответствующеедиапазону умеренной резистентности, данный штамм былзарегистрирован как VRSA (ванкомицинорезистентный S.aureus) ввиду клинической неэффективности ванкомицина. У этого штамма не было найдено ни одного изранее известных механизмов резистентности к ванкомицину; отмечено только увеличение толщины клеточнойстенки и концентрации пенициллин-связывающих белков 2и 2а.

Далееодно за другим последовали сообщения о выделении из клинического материалаштаммов S.aureus с МПК к ванкомицину8 мг/л, обозначенных как VISA (S.aureus со сниженнойчувствительностью к ванкомицину).

Врезультате углубленного исследования ванкомицинорезистентностиу MRSA при скрининге более чем 2000 штаммов из различных стационаров быловыявлено от 1 до 25%(!) штаммов с гетерогенной (индуцибельной)резистентностью к ванкомицину,экспрессирующих ее с частотой около 1 клетки на 1млн. Такие штаммы могут являться предше ственниками VRSA.

Специалистыпока не пришли к согласию, какой термин использовать: VRSA или VISA. Этосвязано с тем, что, несмотря на значения МПК, соответствующие диапазонуумеренной резистентности, налицо клиническаянеэффективность ванкомицина при терапии VRSA- иVISA-инфекций.

Многиеспециалисты предлагают свои методы скрининга ванкомицинорезистентностиу стафилококков. Однако общепринятые стандарты еще не разработаны.

Такимобразом, чрезвычайно важна разработка методов лабораторной диагностики имониторинга ванкомицинорезистентности, особенно упациентов, получающих или получавших ванкомицин/ тейкопланин, и при неэффективности этой терапии.

Следуетразработать методики контроля за VRSA-инфекциями. Для предупрежденияраспространения VRSA необходимо изолировать больных и носителей S.aureus. Кроме того, применение антибиотиков должнопредусматривать снижение числа необоснованных назначений ванкомицина.

ВРоссии пока не описано ни одного штамма S.aureus сосниженной чувствительностью к ванкомицину. Вероятнеевсего это связано с редким использованием ванкомицинав клинической практике.

еще рефераты
Еще работы по медицине