Реферат: Геном человека

Секвенирование генома человека. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот – ДНК и РНК) – это определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Для секвенирования применяются методы Эдмана, Сэнгера, Максама и Гилберта и другие [36].

Секвенирование ДНК по Сэнгеру: «плюс-минус» метод. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров – синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента – фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включает два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводят полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищают от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делят на восемь частей. После этого в «плюс» системе проводят четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в «минус» системе – в отсутствие каждого из них. В результате, в «минус» системе терминация происходит перед dNTP данного типа, а в «плюс» системе – после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяют с помощью электрофореза, «считывают» сигнал и определяют последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод «терминаторов». Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В основе метода тоже лежит ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров используются синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивают добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирают экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требуется провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгоняются в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определяется последовательность нуклеотидов.

Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации.Метод основан на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяют на четыре аликвоты и каждую обрабатывают реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых — по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.

Автоматическое секвенирование ДНК [37].В основе автоматического секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP(*). Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки.

Cеквенаторы.Современные секвенаторы можно разделить по типу проводимого электрофореза на капиллярные и те, в которых разделение происходит в гелевых пластинах. Последние могут также различаться по количеству детектируемых красителей: один, два или четыре. Капиллярные секвенаторы выпускаются только в варианте, использующем детекцию четырех флуоресцентных красок.

Наиболее успешным секвенатором начала 1990-х стал ABI 373 (Applied Biosystems). В этой модели используется одновременная детекция четырех красителей (TAMRA, FAM, ROX, JOE), возбуждаемых излучением аргонового лазера. Среди секвенаторов, детектирующих флуоресценцию одного красителя, можно выделить секвенатор MicroGene Blaster фирмы Visible Genetics. MicroGene Blaster позволяет одновременно проводить анализ четырех образцов, меченных Cy5.5, на 16-ти дорожках.

Секвенаторы, работающие на двух красителях в инфракрасной области спектра, выпускает фирма LI-COR. Ее основная машина — IR2 DNA Sequencer. Конкурентом IR2 DNA Sequencer стал секвенатор ABI Prism 377, который пришел на смену ABI 373. Основное новшество этой машины заключается в замене оптической фильтрации флуоресценции, которая использовалась в ABI 373 для разделения спектров испускания красителей, на «виртуальную» фильтрацию. Схожая технология записи и обработки данных используется в другом секвенаторе фирмы Applied Biosystems — ABI Prism 310. Это однокапиллярный секвенатор, способный в автоматическом режиме последовательно просканировать 96 образцов.

ABI Prism 310 стал пионером капиллярной технологии в секвенировании. Нынешнее поколение капиллярных секвенаторов представляет собой уже мультикапиллярные машины, некоторые из которых демонстрируют гораздо более высокую производительность даже в сравнении с ABI 377. В зависимости от поставленных задач можно остановить свой выбор на восьмикапиллярном Beckman CEQ 2000 (Beckman Coulter), шестнадцатикапиллярном секвенаторе ABI Prism 3100 или 96-ти капиллярных ABI Prism 3700 и MegaBACE 1000 (Amersham-Pharmacia-Biotech-Molecular Dynamics).

Проект «Геном человека». В 1988 г. один из первооткрывателей двойной спирали ДНК, Нобелевский лауреат Джеймс Уотсон, публично высказал мысль о том, что наука вплотную приблизилась к раскрытию химической основы наследственности «царя природы» – человека [38]. К тому времени было уже известно, что его геном, т.е. совокупность всех генов и межгенных участков ДНК, составляет около 3 млрд. пар нуклеотидов. Эта величина казалась необозримо большой, и сама мысль, что такой объем информации может быть получен, представлялась фантастической.

Противники расшифровки генома считали поставленную задачу нереальной, ведь ДНК человека в десятки тысяч раз длиннее молекул ДНК вирусов или плазмид. Главный аргумент против был: «проект потребует миллиарды долларов, которых недосчитаются другие области науки, поэтому геномный проект затормозит развитие науки в целом. А если все-таки деньги найдутся и геном человека будет расшифрован, то полученная в результате информация не оправдает затрат...» Однако Дж.Уотсон остроумно парировал: «лучше не поймать большую рыбу, чем не поймать маленькую». Аргумент был услышан – проблему генома вынесли на обсуждение в конгресс США, и в итоге была принята национальная программа «Геном человека».

Одновременно с Дж. Уотсоном в 1988 г. с аналогичной идеей выступил выдающийся российский молекулярный биолог и биохимик, академик А.А.Баев (1904–1994). После консультаций с коллегами он обратился к М.С.Горбачеву с письмом, в котором предложил организовать государственный научный проект по изучению генома человека. В России, как и за ее пределами, эта идея также была встречена весьма критически, однако время шло, и очень скоро научное сообщество во всем мире стало обсуждать ее всерьез. С 1989 г. и в США, и в СССР функционируют соответствующие научные программы; позднее возникла Международная организация по изучению генома человека (HUGO), вице-президентом которой несколько лет был академик А.Д.Мирзабеков.

Чтобы последовательно приближаться к решению проблемы картирования генов человека, было сформулировано пять основных целей:

1) завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии, не превышающем в среднем 2 млн оснований (1 млн оснований принято называть 1 мегабаза, сокращенно Мб, от англ. слова base – основание);

2) составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0,1 Мб);

3) получить карту всего генома в виде охарактеризованных по отдельности клонов (5 тыс. оснований в клоне, или 5 килобаз, Кб);

4) завершить к 2004 г. полное секвенирование ДНК (разрешение 1 основание);

5) нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека (к 2005 г.).

Ожидалось, что, когда все указанные цели будут достигнуты, исследователи определят все функции генов и разработают методы биологического и медицинского применения полученных данных.

В результате 26 июня 2000 г. на совместной пресс-конференции с участием президента США и премьер-министра Великобритании представители двух исследовательских групп – International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC)и «Celera Genomics» – объявили, что работы по составлению чернового варианта генома человека успешно завершены. Началась новая эра развития человечества – постгеномная.

Создание первого «чернового» варианта генома человека обошлось в 300 млн. долл. Однако на все исследования, включая сравнительные анализы и решение ряда этических проблем, было выделено в сумме около 3 млрд. долл. «Celera Genomics» вложила столько же, причем всего за шесть лет. Цена колоссальная, но эта сумма ничтожна в сравнении с той выгодой, которую получит страна-разработчик от ожидаемой вскоре окончательной победы над десятками серьезных заболеваний. А уже в 2007 г. Дж.Уотсону были подарены два DVD-диска с его геномом общей стоимостью 1 млн. долл.

Российский проект «Геном человека» (РПГЧ). Одновременно с США в СССР по решению правительства было открыто финансирование и организован Научный совет по программе «Геном человека» под руководством А.А. Баева со штаб-квартирой в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН [39]. Совет весьма быстро создал инфраструктуру, объединил исследования многих разрозненных групп, преодолевая ведомственные барьеры и географическую удаленность. В настоящее время в программу вовлечены 90 исследовательских групп из 30 научных организаций. Основными целями программы являлось физическое и функциональное картирование генома человека, разработка молекулярной диагностики наследственных и злокачественных заболеваний, компьютерный анализ генома (биоинформатика), поиск новых генов человека и выявление их функции.

Вклад России в международное сотрудничество признан в мире: 80 отечественных исследователей являются членами HUGO (избрание в эту организацию осуществляется тайным голосованием на основании международных публикаций кандидатов). За первые 12 лет функционирования российской национальной программы опубликовано свыше 1000 статей, около трети из них – в международных журналах, в банках данных зарегистрировано более миллиона нуклеотидных пар фрагментов ДНК человека, многие сотни маркеров, что имеет большое значение для детального анализа генома человека.

Вопреки ограниченной финансовой поддержке, программауспешно выполняется, прежде всего благодаря следующим факторам:

· широкое и постоянное международное сотрудничество с ведущими лабораториями Европы и США, тесные и эффективные контакты с HUGO;

· четкое организация работы Научным Советом; кооперация и координация работы исследовательских групп в России, открытая конкуренция за гранты между исследовательскими группами, регулярное и быстрое распространение информации через электронные средства;

· многие одаренные компьютерщики работают в РПГЧ. Созданы два Информационных центра (проф. Ю.П.Лысов, Москва и проф. Н.А.Колчанов, Новосибирск).

Особое внимание РПГЧ уделяет медико-генетическим аспектам изучения генома. Разработана и введена в медицинскую практику в ряде регионов России молекулярно-генетическая диагностика некоторых широко распространенных заболеваний.

Секвенирование и проект «Геном человека». Важная составляющая проекта «Геном человека» – разработка новых революционизирующих методов исследований. Развитые еще до начала выполнения проекта методы первого поколения включали применение рестрикционных ферментов; создание гибридных молекул, их клонирование и перенос участков ДНК с помощью векторов в клетки-доноры (чаще всего в клетки кишечной палочки, E. coli и дрожжевые клетки; иногда этот процесс называют амплификацией генов in vivo); синтез ДНК на матрицах информационной РНК (сДНК-синтез); методы секвенирования генов; получение практически неограниченного количества копий генов с помощью PCR-машин (амплификация участков ДНК in vitro); методы, предназначенные для разделения молекул ДНК по плотности, массе, различной вторичной структуре.

Рис. 3.12. Нарастание числа секвенированных генов человека по годам последней трети ХХ века (по[40]).

Благодаря проекту «Геном человека» были развиты новые методы (второго и даже третьего поколения), которые включают как главный компонент автоматизацию большинства процессов (см. табл. 3.3). Это привело к быстрому росту числа секвенированных генов уже в первые годы существования проекта (рис. 3.12).

Таблица 3.3. Автоматизированные методы анализа последовательностей ДНК, разработанные в рамках проекта «Геном человека» (приводится по [40]).