Реферат: Генетический код

Лекция1. Структурагеномов про- и эукариот. Генетический код

 

1. 1928г.Опыты Фредерика Гриффита

Гриффит работал с пневмококками- бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков:капсульный и бескапсульный. Капсульный — патогенный (вирулентный), приинфицировании таким штаммом мыши погибают, бескапсульный — непатогенный. Привведении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявшихвирулентность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентныхбактерий, животные погибали в результате размножения капсульных вирулентныхформ. Обнаруженное явление Гриффит интерпретировал как трансформацию.

В 1944г. этот экспериментбыл повторен Освальдом Эйвери, Колином Мак-Леодом и Маклином Мак-Карти вварианте смешивания бескапсульных пневмококков с взятыми от капсульных белками,полисахаридами или ДНК. В результате этого эксперимента была выявлена природатрансформирующего фактора.

Трансформирующим факторомоказалась ДНК.

 

2. 1952г.Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз

Фаги (бактериофаги) — этовирусы, размножающиеся в бактериях.

E. сoli — кишечнаяпалочка (эубактерия).

Суть опыта: фаги, у которых белковая оболочкабыла мечена радиоактивной серой (S35), а ДНК — радиоактивным фосфором (Р32),инкубировали с бактериями. Затем бактерии отмывали. В смывных водах необнаруживали Р32, а в бактериях — S35 Следовательно, внутрь попала только ДНК.Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов,содержащих и белковую оболочку, и ДНК.

Отсюда следовалоднозначный вывод о том, что именно ДНК выполняет генетическую функцию — несетинформацию как о создании новых копий ДНК, так и о синтезе фаговых белков 1957г.Опыты Френкеля – Конрата

Френкель-Конрат работал свирусом табачной мозаики (ВТМ). В этом вирусе содержится РНК, а не ДНК. Былоизвестно, что разные штаммы вируса вызывают разную картину поражения листьевтабака. После смены белковой оболочки «переодетые» вирусы вызываликартину поражения, характерную для того штамма, чья РНК была покрыта чужимбелком.

Следовательно, не толькоДНК, но и РНК может служить носителем генетической информации

Молекулярная биология — это наука о механизмах хранения,воспроизведения, передачи и реализации генетической информации, о структуре ифункциях нерегулярных биополимеров — нуклеиновых кислот и белков.

Нуклеотиды

/> />

Принципы строения ДНК

1.Нерегулярность.

Существует регулярныйсахарофосфатный остов, к которому присоединены азотистые основания. Ихчередование нерегулярно.

2.Антипараллельность.

ДНК состоит из двухполинуклеотидных цепей, ориентированных антипараллельно. 3`-конец однойрасположен напротив 5`- конца другой.

3.Комплементарность(дополнительность).

Каждому азотистомуоснованию одной цепи соответствует строго определенное азотистое основаниедругой цепи. Соответствие задается химией. Пурин и пиримидин в паре образуютводородные связи. В паре A-Т две водородные связи, в паре Г-Ц — три.

4.Наличие регулярнойвторичной структуры.

Две комплементарные,антипараллельно расположенные полинуклеотидные цепи образуют правые спирали собщей осью.

Формыдвойной спирали ДНК

В основной — В-формена виток приходится 10 комплементарных пар. Плоскости азотистых основанийперпендикулярны оси спирали. Соседние комплементарные пары повернуты друготносительно друга на 36/>. Диаметр спирали 20Å,причем пуриновый нуклеотид занимает 12Å, а пиримидиновый — 8Å. А-форма — 11 пар азотистых оснований на виток. Плоскости азотистых оснований отклоненыот нормали к оси спирали на 20/>. Отсюда следует наличиевнутренней пустоты диаметром 5Å. Высота витка 28Å. Такие жепараметры у гибрида из одной цепи ДНК и одной цепи РНК.

С-форма — шаг спирали 31Å, 9.3 пароснований на виток, угол наклона к перпендикуляру 6/>.

Все три формы — правозакрученные спирали.

Есть еще несколько формправых спиралей и всего одна левая спираль (Z -форма). Высота витка в Z-форме-44.5 Å, на виток приходится 12 пар нуклеотидов. Ни А-, ни Z- формы немогут существовать в водном растворе без дополнительных воздействий (белки илисуперспирализация).

 

Отличия между ДНК и РНК

ДНК РНК Сахар Дезоксирибоза Рибоза Азотистые основания А, Т, Г, Ц А, У, Г, Ц Количество цепей в молекуле

99.99% двойная спираль

0.01% одноцепочечная.

99.99% одноцепочечная
0.01% двухцепочечная

Форма молекулы

Все одноцепочечные- кольцевые.

Большинство двухцепочечных — линейные, часть- кольцевые.

Линейные молекулы

Сюрпризымитохондриального генома

Несмотря на то, что вгеномах митохондрий млекопитающих и дрожжей содержится приблизительноодинаковое количество генов, размеры дрожжевого генома в 4-5 раз больше — около80 тыс. пар нуклеотидов. Хотя кодирующие последовательности мтДНК дрожжейвысоко гомологичны соответствующим последовательностям у человека, дрожжевыемРНК дополнительно имеют 5'-лидерную и 3'-некодирующую области, как ибольшинство ядерных мРНК. Ряд генов содержит еще и интроны. Так, в гене box,кодирующем цитохромоксидазу b, имеется два интрона. Из первичного РНК-транскриптаавтокаталитически (без участия каких-либо белков) вырезается копия большейчасти первого интрона. Оставшаяся РНК служит матрицей для образования ферментаматуразы, участвующей в сплайсинге. Часть ее аминокислотной последовательностизакодирована в оставшихся копиях интронов. Матураза вырезает их, разрушая своюсобственную мРНК, копии экзонов сшиваются, и образуется мРНК дляцитохромоксидазы b. Открытие такого феномена заставило пересмотретьпредставление об интронах, как о “ничего не кодирующих последовательностях”.

/>

 


Сверхспирализация.

Образованиесверхспиральной ДНК происходит во всех прокариотических и эукариотическихклетках и во многих вирусах, поражающих эукариот. Сверх спиральная(сверхскрученная) ДНК образуется при введении в двойную спираль ДНКдополнительных витков (сверхвитков). В результате в молекуле возникаетнапряжение, которое проявляется, в частности в том, что ось двойной спиралисама закручивается в спираль (спирализуется) – см. на примере кольцевойзамкнутой двуцепочечной ДНК (прозрачка). Полученная таким образомсуперспиральная ДНК должна быть стабилизирована, поскольку в результате болееплотной упаковки отрицательно заряженные фосфатные группы оказываются внепосредственной близости друг от друга. Взаимное отталкивание ихкомпенсируется путем связывания их с положительно заряженными белками (есть неу всех вирусов, но у всех про-и-эукариотах) и с малыми молекулами, представляющимисобой полиамины, например, спермидин  (их нет только в вирусах).

Упаковка ДНК в клеткахпрокариот.

Сверхспиральный участокДНК в комплексе с гистоноподобными белками, обладающими сродством к ДНК, иполиаминами образует «бусину» диаметром около 12 нм. Внутри бусины ось двойнойспирали ДНК перекручена и образует примерно 6 витков. Бусины соединены междусобой участками ДНК, в которых сверхспиральность отсутствует, и объединяютсятаким образом в структуру, напоминающую ожерелье. Такая ДНК образует далеебольшие петли, которые стабилизируются и окончательно конденсируются благодарявзаимодействию с соответствующими белками и РНК.

Упаковка ДНК в клеткахэукариот

Включает в себяассоциациюсверхспирализованной ДНК с различными белками (гистонами –основные белки,11,3-21 кДа, внутри бусины Н2А, Н2В, Н3 и Н4 ), в результате которой образуетсякомплекс, называемый хроматином. Хроматин в свою очередь образует соленоидоподобнуюструктуру, с которой связываются хромосомные структурные белки (ониобразуют каркас на котором идет окончательная конденсация хроматина, этотбелковый остов не разрушается даже после удаления всех гистонов);получившийся в результате комплекс – хромосома.

Хроматин состоит из двуцепочечной ДНК, котораяобвивается вокруг гранул, состоящих из гистонов. Такая структура похожая набусы – хроматиновое волокно. Каждая бусина – это нуклеосома (диаметр ееоколо 10 нм, впервые установил ее структуру Клуг с сотрудниками).Нуклеосомы соединяются с помощью гистона Н1, ДНК этих связующих участков –соединительная (или линкерная) ДНК. Н1 не участвует в стабилизации структурыхромосомы, а скорее играет роль в регуляции транскрипционной активностихроматина. В результате конденсации в хроматин продольные размеры ДНКуменьшаются в 5-6 раз.

Топоизомеразы. Переходы вмолекулах ДНК, связанные с изменением степени сверхспирализации (топологическиеизомеры ДНК), катализируются ферментами топоизомеразами. Однитопоизомеразы вызывают релаксацию сверхспиральной ДНК, а другие напротив,приводят к появлению в ней сверх витков. Так например,  ДНК-гираза E. Coli переводит двуцепочечную кольцевую ДНК в состояние сотрицательной сверхспирализацией. Это необходимо для снятия положительныхсверхвитков, возникающих при репликации (и транскрипции) из-за раскручиваниядвойной спирали ДНК. (см. действие антибиотиков).

Гены. Структурный ген –это наименьший отрезок ДНК или РНК, кодирующий полную аминокислотнуюпоследовательность какого-либо белка. В клетке высших организмов можетсодержаться до 100 000 генов (по последним данным их существенно меньше).Однако ДНК в клетке столько, что ее хватило бы на образование в 10 раз большегочисла генов. «лишняя ДНК» — в составе интронов, спейсерной ДНК, например. Ввирусах может быть лишь 5-6 генов, а геном прокариот составляет примерно 0,1% отгенома высших.

Хромосома прокариот. Структурныегены подразделяются  на три основных типа: независимые гены(транскрибируются без каких-либо механизмов регуляции транскрипционнойактивности), транскрипционные единицы (транскриптоны – группа следующихдруг за другом генов, транскрибируемых совместно, обычно это гены белков илин.к., связанных между собой в функциональном отношении), и опрероны (группаследующих подряд структурных генов, находящихся под контролем участка ДНК — оператора). Кроме того в прокариотической клетке могут находиться более мелкиереплицирующиеся единицы – плазмиды (кольцевые молекулы ДНК, в них естьучастки способные к перемещению – транспозоны, они часто содержат генырезистентности к антибиотикам, перемещаясь из одной клетки в другую в процессеконьюгации, гены резистентности быстро распространяются в популяции бактерий).

Клетки эукариотиспользуют в качестве генетического материала лишь двуцепочечную ДНК.Структурные гены в них подразделяются на независимые гены (ихтранскрипция не связана с транскрипцией других генов, их активностьрегулируется, например гормонами), повторяющиеся гены (например, генрибосомной 5S-РНК повторятся много сотен раз,причем повторы следуют вплотную друг за другом) и кластерные гены (этолокализованные в определенных участках – локусах – хромосомы группы различныхгенов с родственными функциями, иногда также в виде повторов, например, кластергистоновых генов в геноме человека повторяются 10-20 раз). В кодирующиепоследовательности этих генов могут вклиниваться некодирующие – интроны(разбивают кодирующую – экспрессируемую часть гена – следовательно дляполученной с этой матрицы мРНК нужен сплайсинг). Кроме того, между генами могутнаходиться участки ДНК с большим числом повторов (сателлитной ДНК – втеломерных и центромерных участках хромосомы – функция этой ДНК пока неясна,вероятно структурная) и спейсерной ДНК (располагается между генами),транскрибируемой и нетранскрибируемой.

Неядерные геномы. ДНКмитохондрий и хлоропластов.

Отличительная особенностьклеток эукариот состоит в том, что часть генетической информации у нихзаключена в молекулах, находящихся вне хромосом, локализованных в ядре.Существует два таких типа цитоплазматических ДНК: одни – в митохондрияхэукариот, другие – в хлоропластах зеленых растений и водорослей. Как и всецитоплазматические элементы, они наследуются по материнской линии, а не позаконам Менделя.

ДНК митохондрий. Это замкнутые кольцевыесверхспиральные дуплексные ДНК (прозрачка). Размер у животных около 20 т.п.н.,у дрожжей – 80 т.п.н., у растений – от нескольких сотен до нескольких тысячт.п.н. Митохондриальная ДНК эволюционирует быстрее, чем ядерная, и мутации вней происходят почти в десять раз чаще. Рассмотрим на примере митохондриальнойДНК дрожжей. Есть гены, кодирующие белки, гены кодирующие РНК, вставочныепоследовательности, есть сайты начала репликации, кодирующие субединицыАТФ-азного комплекса.

ДНК хлоропластов сходна с ДНК митохондрий. Эта ДНК –кольцевой дуплекс (прозрачка), содержащий какое-то количество (но далеко невсе) генов, существенных для функционирования (например, кодирование фрагментаключевого фермента фотосинтеза – рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилаза) иподдержания структуры хлоропластов, и имеет достаточно большую длину – 120-180т.п.н. в отличие от ДНК митохондрий в пределах вида довольно консервативна.

Есть примеры межгеномногообмена: перенос сегментов хлоропластной ДНК в ядерную ДНК, митохондриальной ДНКв ядерную ДНК (дрожжи, саранча, крыса), хлоропластной ДНК в митохондриальнуюДНК. Механизм таких переносов пока не установлен.


Лекция 2.Структура хроматина. Полиморфизм ДНК

В живыхорганизмах молекулы ДНК представляют собой либо очень длинные, либо замкнутые вкольцо двуспиральные молекулы, поэтому любой процесс, связанный с передачейнаследственной информации, должен наталкиваться на серьезные топологическиепроблемы: возникновение положительной (+) или отрицательной (-)сверхспирализации ДНК, образование катенанов или узлов.

СверхспирализованнаяДНК обладает значительным запасом энергии по сравнению с ее релаксированнойформой. Следовательно, локальное расплетание двойной спирали ДНК сотрицательными сверхвитками будет приводить к сбросу напряжениясверхспирализации и поэтому энергетически выгодно. Это отчетливо проявляется втом, что отрицательная сверхспирализация заметно стимулирует переход ДНК изправой В-формы в левую Z-форму. Отрицательная сверхспирализация ДНК облегчаетсвязывание с ней белков, раскручивающих ее двойную спираль.

Решениеназванных топологических проблем обеспечивают ДНК-топоизомеразы — ферменты,изменяющие топологию ДНК (рис. 49). Топоизомеразы релаксируютсверхспирализованные молекулы ДНК, снимая их внутреннее напряжение путемвнесения одно и двуцепочечных разрывов с последующим их восстановлениемлигированием). По механизму действия различают ДНК-топоизомеразы двух типов — I и II.

ДНК-топоизомеразыI — мономерные белки,релаксируют ДНК без затраты энергии путем внесения одноцепочечных разрывов.ДНК-топоизомеразы II функционируют в виде димеров (у эукариот) и тетрамеров (у прокариот),осуществляя АТР-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносомцепей через разрыв и его лигированием.

Для внесенияодноцепочечного разрыва в ДНК все ДНК-топоизомеразы используют остатоктирозина, который осуществляет нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК собразованием фосфотирозина. В результате ферменты оказываются ковалентносвязанными с 5'-или З'-концами ДНК в одноцепочечном разрыве.

Топоизомеразыподтипа 1-5' связываются преимущественно с одноцепочечными участками ДНК,

осуществляяее разрыв с образованием 5'-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центрафермента. Через образовавшийся разрыв проходит либо одноцепочечная ДНК (снятиевитка), либо двуцепочечная (образование узла или катенана). Ферменты этого типаснимают только отрицательную суперспирализацию. Характерны дляпрокариот.

Топоизомеразыподтипа 1-3' связываются с двуцепочечной ДНК, разрывают одну цепь собразованием З'-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента.Через разрыв проходит вторая цепь дуплекса, уменьшая плотностьсуперспирализации ДНК; знак суперспирализации существенной роли не играет.Характерны для эукариот.

Топоизомеразытипа IIсвязываются с двуцепочечной ДНК и осуществляютразрыв обеих цепей с образованием двух 5'-фосфодиэфирных связей с тирозинамиактивного центра. В образовавшуюся щель проходит вторая двуцепочечная ДНК, ирезультатом является изменение числа положительных или отрицательныхсупервитков на 2 (в отличие от ферментов типа I, изменяющих числосупервитков на единицу за шаг).

Этот ферментспособен катенировать, декатенировать и развязывать узлы интактной ДНК. Длямногократного повторения цикла требуется АТР (рис. 50).

ТопоизомеразаII Е. coli(ДНК-гираза) относится кферментам типа II, но не требует АТР. Она индуцирует образование отрицательныхсупервитков в релаксированных кольцевых ДНК. Гираза взаимодействует с ДНК такимобразом, что последняя наматывается вокруг белка. При этом возникаетположительная сверхспирализация в тех местах молекулы ДНК, которые связаны сбелком. Затем фермент разрывает обе нити ДНК и переносит двойную нить свнутренней стороны на внешнюю, после чего скрепляет оба разрыва, превращаяположительную петлю в отрицательную (рис. 51). Это особенно важно для инициациирепликации, а также необходимо для ее элонгации и терминации.

ДНК-топоизомеразаII является жизненно важнымферментом любого эукариотического организма. Выяснена роль ДНК-топоизомеразы вформировании высших уровней структуры хроматина, а именно, участии фермента вобразовании петель хроматина во время конденсации хромосом.

Гистоны составляют большинство основныхбелков хроматина и находятся примерно в том же количестве, что и ДНК. Поотносительной доле основных аминокислот каждого типа, которую выражаютотношением лизин/аргинин, сначала охарактеризовали пять типов гистонов. Следэтой классификации до сих пор остается в названиях гистонов. Практически у всехэукариот обнаруживают одни и те же классы гистонов. Их свойства суммированы втабл. 29.1.

Гистоны четырех классовпрямо взаимодействуют с ДНК и образуют в хроматине серию частиц первого уровняорганизации. Консервативность типов гистонов на протяжении эволюции можнообъяснить необходимостью сохранения этой важнейшей реакции. Пятый классгистонов принимает участие во взаимодействиях между частицами. Постоянствоклассов гистонов позволяет предполагать, что взаимодействия типа ДНК—гистоны,гистон—гистоны и гистон—негистоновые белки могут быть в основном похожими уразных видов. Отсюда мы можем сделать заключение об общих механизмахобразования как первичных частиц, так и последующих структур более сложногопорядка, состоящих из серий частиц.

Гистоны первых четырехклассов имеют значительное количество как кислых, так и основных аминокислот.Поэтому эти белки несут высокий заряд. Отношение основных аминокислот к кислымнаходится в диапазоне 1,4-2,5. Эти гистоны подразделяются на две группы.

К аргинин-богатымотносятся два вида гистонов: Н3 и Н4. Они принадлежат к наиболее консервативнымиз всех известных белков. Аминокислотные последовательности этих белковидентичны даже у таких удаленных видов, как корова и горох. В гистонах Н3 и Н4других видов обнаружены только редкие аминокислотные замены. Консервативностьцелой последовательности говорит о том, что все ее аминокислоты имеютсущественное значение для выполнения функции белка. По логике вещей эта функциядолжна быть одинаковой у огромного большинства различных видов, чтосвидетельствует в пользу концепции об общей основе для структуры хроматина.

К гистонам, умереннообогащенным лизином, относятся два белка. Их называют Н2А и Н2В (впротивоположность их номенклатурному обозначению это не родственные, анезависимые белки). У различных эукариот находят те же самые два типа гистонов,но у них обнаружены заметные межвидовые вариации в аминокислотной последовательности.

Пятый класс представлен гистонами,очень богатыми лизином; он состоит из нескольких достаточно близкородственныхбелков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. Это гистоны H1 (вэритроцитах птиц существует вариант, названный Н5). У этих гистонов обнаруженызначительные межвидовые и межтканевые вариации (у дрожжей, по-видимому,гистонов данного класса нет). Хотя эти гистоны являются самыми основнымигистонами, их легко можно выделить из хроматина, полностью растворив в солевомрастворе (0,5М).

Как и следует изназвания, негистоны — это все другие белки хроматина. Предполагается поэтому,что они обладают большими видовыми и тканевыми различиями, хотя строгих данныхо степени их разнообразия пока нет. Эти белки составляют меньшую долю от всеймассы белков хроматина, чем гистоны. Кроме того, сюда относится намного большеечисло белков, так что любой индивидуальный белок присутствует в значительноменьшем количестве, чем любой гистон.

В класс негистоновыхбелков могут попасть белки, связанные с экспрессией генов, и белки, участвующиев организации структур высшего порядка. Так, в числе наиболее выдающихсянегистонов можно назвать РНК-полимеразу. HMG-белки (высокомобильная группа)составляют отдельный, хорошо различимый подкласс негистонов. Основная проблема,возникающая при работе с другими негистоновыми белками — их загрязнение другимиядерными белками

Гистоны удаляют путемконкурентного замещения полианионами декстрансульфатом и гепарином.

Нуклеосомы

Если интерфазные ядрасуспендировать в растворе с низкой ионной силой, они разбухнут и в местахразрывов из них высвободятся нити хроматина. На рис. 29.1 показано лизировавшееядро, из которого вытекают нити. В некоторых местах нити хроматина состоят изплотноупакованного материала, но в тех местах, где они вытянуты, можно видеть,что они состоят из отдельных частиц. Эти частицы называют нуклеосомами. Вособенно вытянутых участках видно, что индивидуальные нуклеосомы соединенытонкой нитью — это свободная двухцепочечная ДНК. Таким образом, непрерывнаядвухцепочечная ДНК проходит через серию частиц.

Индивидуальные нуклеосомыможно получить, обработав хроматин ферментом нуклеазой микрококков. Этоэндонуклеаза, которая разрезает нить ДНК в местах соединения междунуклеосомами. Сначала освобождаются группы частиц, а потом отдельныенуклеосомы. Мономерные нуклеосомы отчетливо видны на рис. 29.2 в видекомпактных частиц (настоящая форма которых похожа на диск; см. ниже). Ониседиментируют примерно со скоростью 11S, что соответствует общей массе в диапазоне250000-300000 дальтон. Отношение белок/ДНК составляет около 1,25. Димеры,тримеры и т.д. имеют соответствующие свойства при биохимическом анализе или принаблюдении под электронным микроскопом.

Мономерные нуклеосомысодержат ДНК ( ~ 200 п. н.), связанную с гистоновым октамером. Этот октамерсодержит гистоны Н2А, Н2В, НЗ и Н4 — по две копии каждого. Иногда их называютгистоновой сердцевиной (гистоновым кором). Такие комплексы схематическиизображены на рис. 29.3.

Нуклеосома — белковыйкомплекс, состоящий из гистонов состава [2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4].

Характеристика нуклеосомы

нуклеосома 5,5x11нм 146пн нуклеосома+H1 166пн нуклеосома+H1+линкер (участок м-у н.) 200пн

ДНК в B-форме перекрученана 0,25-0,35 пн на виток спирали, при этом шаг спирали 10,2 пн/виток (у В-формыв растворе — 10,5 пн/виток). Такая ДНК делает 1,75 левых оборота вокругнуклеосомы. Комплекс не разрушается при разрушении плеч гистонов. N-концевыедомены Н3 контактируют с ДНК на входе в коровую частицу и выходе из нее, Н4 связываетсяс внутренней частью ДНК нуклеосомы H1 — линкерный гистон и выполняет функцию связывания нуклеосом между собой, однакоу дрожжей H1 не обнаружен, а его аналог Hho1p не выполняет видимой роли всворачивании ДНК и взаимодействии нуклеосом между собой.

Любое дополнительноеувеличение содержания белка зависит от присутствия небольшого количестванегистоновых белков, которые связываются с нуклеосомами.

Нуклеосомную ДНК можноразделить на две части.

ДНК минимальнойнуклеосомы имеет постоянную длину 146 п.н. и относительно устойчива красщеплению нуклеазами. (Другие нуклеазы, в том числе и нуклеаза микрококков,останавливаются перед этим отрезком ДНК.)

Линкерная ДНК заключает в себе остатокповторяющейся единицы. Ее длина может варьировать in vivo от такого малогоразмера, как 8 п. н., до такого большого, как 114 п.н., на 1 нуклеосому.

/>

Рассматривая модель,изображенную на рис. 29.8 в виде поперечного сечения, можно видеть, что двавитка ДНК лежат близко один к другому. Это, возможно, имеет функциональноеобъяснение. Один виток вокруг нуклеосомы захватывает 80 п.н., так что точки,отстоящие на это расстояние в свободной двойной спирали, могут оказатьсярасположенными достаточно близко друг к другу на нуклеосоме. Таким образом,если ДНК-связывающий белок одновременно контактирует с двумя витками ДНК, какпоказано на рис. 29.9, узнаваемые им последовательности могут отстоять надвойной спирали ДНК гораздо дальше, чем величина соединяющего их участка вбелке. Часто обсуждается вопрос о том, может ли стартовая точка транскрипциинаходиться поблизости от положения — 80 так чтобы обе цепи одновременноконтактировали с РНК-полимеразой. (Это внесло бы конкретную деталь в обобщеннуюмодель, показанную на рис. 11.8).

Плотность упаковкиотдельной нуклеосомы равна примерно 6 (так как 67 нм ДНК упакованы в частицудлиной около 11 нм). Можно упаковать серию нуклеосом достаточно плотно, чтобысохранить это отношение. Множество работ по изучению наборов нуклеосом быловыполнено на вирусе SV40.

Важным параметром вописании структуры хроматина является степень суперспирализации, которая можетвозникнуть на нескольких уровнях:

суперспирализация можетбыть результатом упаковки ДНК на нуклеосоме.

суперспирализация можетбыть следствием укладки нуклеосом в структуру более высокого уровня.

Состояниесуперспирализации во многом может удерживаться белками (по принципу, описанномув гл. 28). Прямые измерения плотности суперспирализации позволят узнать среднеенапряжение скручивания ДНК, возникающее в результате образования свободныхсупервитков, но таким образом нельзя обнаружить суперспирализации, котораяудерживается в ходе упаковки ДНК.

Для мини-хромосомы вирусаSV40 можно прямо измерить степень суперспирализации в самой нуклеосоме.Мини-хромосома может иметь свободные супервитки в гирлянде нуклеосом, а такжесупервитки, удерживаемые на нуклеосоме. Процедура измерения суперспирализации,обусловленная только структурой нуклеосом, показана на рис. 29.10. Сначалаосвобождаются свободные супервитки самой мини-хромосомы, так что гирляндануклеосом образует кольцо с нулевой суперспирализацией. Затем экстрагируютгистоновые октамеры. В результате этой процедуры освободившаяся ДНК свободнорасправляется. Таким образом каждый супервиток, который сдерживается вмини-хромосоме, проявится в депротеинизированной ДНК как — 1 оборот. Так можноизмерить общее число супервитков в ДНК вируса SV40.

Организация нуклеосом(гистонов) и ДНК

До сих пор мырассматривали конструкцию нуклеосомы, исходя из того, как организованыповторяющиеся единицы длины ДНК на поверхности нуклеосом.

каким образом гистонывзаимодействуют друг с другом и с ДНК. Взаимодействуют ли гистоны только вприсутствии ДНК или способны независимо собираться в октамеры?

Мы еще многого не знаем оструктуре индивидуальных гистонов в нуклеосоме, но уже стала проясняться ихотносительная локализация. Большинство данных о взаимодействиях гистоновполучено при изучении способности к агрегированию и к образованию перекрестныхсшивок в нуклеосоме.

Способность гистоновагрегировать друг с другом изучена хорошо. Гистоны, богатые аргинином, можнополучать в виде хорошо различимого тетрамера (Н32Н42).Гистоны, умеренно богатые лизином, образуют продукт, который менее четкоохарактеризован, но который, очевидно, образует димер (Н2А • Н2В), имеющийтенденцию к дальнейшей агрегации. Одной из форм образующегося агрегата можетбыть тетрамер (Н2А2 • Н2В2). Два указанных тетрамераназывают гомотипическими (название отражает то, что каждый из них содержиттолько гистоны, относящиеся к одному из исходных классов).

Интактные октамерыгистонов можно получить либо экстракцией хроматина, либо (с большимитрудностями) путем соединения гистонов in vitro в условиях высокой концентрациисоли и белка. Октамер может диссоциировать с образованием гексамера гистонов исвободного димера Н2А • Н2В. В результате отделения второго димера Н2А • Н2Вобразуется тетрамер Н32Н42. Все эти формы можно экстрагировать из хроматина.Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что в нуклеосоме имеетсяцентральное «ядро» (kernel), состоящее из тетрамера Н32Н42,связанного с двумя независимыми димерами Н2А • Н2В.

Перекрестные сшивкипозволяют установить, какие пары гистонов лежат ближе друг к другу внуклеосоме. (Сложность в интерпретации этих данных заключается в том, чтосшивается только небольшая часть гистонов. Поэтому следует оценивать результатыс осторожностью, учитывая типичность большинства взаимодействий.) На основеполученных данных была сконструирована модель организации нуклеосомы.

Сборка нуклеосом

1 способ. обусловленспособностью тетрамера Н32Н42 организовывать ДНК в частицы, которые нескольконапоминают минимальную нуклеосому (по их чувствительности к нуклеаземикрококков). При добавлении димера Н2А • Н2В эти тельца могут превращаться вминимальную нуклеосому. Именно отсюда возникла идея о том, что в структуренуклеосомы существует «ядро» из аргинин-богатых гистонов. Возможно, такой путьиспользуется in vivo, поскольку это согласуется с наблюдением, что гистоны НЗ иН4 включаются в реплицирующийся хроматин, до того как в его состав входятгистоны Н2А и Н2В.

2. способ. Данныеполучены при использовании поперечно-сшитых гистоновых октамеров, которые немогут диссоциировать на отдельные белки, но тем не менее сохраняют способностьсвязывать ДНК с образованием минимальной нуклеосомы. Это говорит о том, что впринципе ДНК может обвиваться вокруг предварительно сформированного октамера.

Из ооцитов Xenopusвыделен белок сборки.

Это пентамер, содержащийидентичные субъединицы по 29000 дальтон.

Это белок, преобладающийв ооцитах, и локализован он в нуклеоплазме.

Антитела, полученныепротив этого белка, реагируют с белками нуклеоплазмы многих эукариот.Следовательно, можно предположить, что этот белок соответствует эволюционнокакой-то универсальной функции, закрепленной в процессе эволюции. Он был названнуклеоплазмином.

В присутствиинуклеоплазмина гистоны могут связываться с ДНК, образуя в физиологическихусловиях (низкая концентрация соли) частицы.

Однако самого по себенуклеоплазмина недостаточно для образования нуклеосом со специфическиминтервалом.

Какова функциянуклеоплазмина?

Это кислый белок, которыйне связывается ни со свободной ДНК, ни с интактными нуклеосомами, но при этомон связывается со всеми индивидуальными гистонами

Реакция насыщается науровне, равном одному пентамеру нуклеоплазмина на октамер гистона.

Нуклеоплазмин, возможно,играет роль «молекулярного сопровождающего», связываясь с гистонами и передаваяих ДНК более регулируемым образом, чем было бы возможно без такого конкурента.Т.е. контролирует сродство гистонов к ДНК В пользу этого предположения говориттот факт, что кислая полиглутаминовая кислота, а также РНК могут действоватьсходным образом в качестве факторов сборки.

Фейзинг. Термином«фазирование» обозначают неслучайное расположение нуклеосомотносительно конкретной последовательности нуклеотидов ДНК в определенныхучастках генома. Позиционирование идет в том числе при помощи специальныхпоследовательностей ДНК, которые обладают тем свойством, что они болееподатливы к изгибу двойной спирали ДНК в этом месте. Перед активацией генануклеосомы присутствуют как в вышерасположенных регуляторныхпоследовательностях ДНК, так и в самом промоторе. Во время индукциитранскрипции такого гена регуляторные факторы (TF‚ связывающиеся с ТАТАбоксом), связываясь с ДНК, прямо иликосвенно вызывают разрушение нуклеосомной структуры соответствующих участковДНК.

Существуют области, вкоторых нет нуклеосом. Такие области могут быть связаны с контролем экспрессиигенов или же с образованием структур более высокого уровня организациихроматина.(Льюин)

Нуклеосомыпри репликации и транскрипции

Приэлектронно-микроскопическом исследовании реплицирующегося хроматина былообнаружено, что обе новообразованные фибриллы содержат нуклеосомы. Если учестьскорость синтеза ДНК эукариот (20 нм/с), то новые нуклеосомы при удвоениихромосомных фибрилл должны возникать со скоростью 3—4 с. Такая высокая скоростьобразования нуклеосом связана с тем, что в момент синтеза ДНК уже существуетпул синтезированных гистонов всех классов, готовых войти в состав нуклеосом.Гистоновые гены, относящиеся к фракции умеренно повторяющихсяпоследовательностей ДНК, представлены в виде множественных копий для каждогогистона. Они активируются вместе с началом синтеза ДНК, поэтому по мерепродвижения репликационной вилки новые участки ДНК могут сразувзаимодействовать с новосинтезированными гистонами. Новосинтезированные гистоныи старые гистоны в составе предшествующих нуклеосом не смешиваются при образованиинуклеосом во время репликации ДНК. Вместо этого октамеры гистонов,присутствующие до репликации, остаются интактными и переходят на дочернийдуплекс ДНК, в то время как новые гистоны собираются в совершенно новыекор-частицы на свободных от нуклеосом участках ДНК. Старые и новые октамерыгистонов распределяются между дочерними дуплексами ДНК случайным образом.

Чтопроисходит со старыми нуклеосомами в вилке репликации ДНК, до конца не ясно.Согласно одной из гипотез, каждая из нуклеосом при подходе к ней репликативнойвилки как бы расщепляется на две «полунуклеосомы», а нуклеосомная ДНКразворачивается, чтобы дать пройти этот участок ДНК-полимеразе. Послеэтого новосинтезированная цепь ДНК связывается со свободными гистонами, которыеесть в избытке в ядре, и образуются новые нуклеосомы на второй цепи ДНК.

Как ужеупоминалось, для активно функционирующих зон хроматина характернодеконденсированное, диффузное, состояние. На этом свойстве хроматина основанодин из методов получения фракций активного хроматина, когда с помощьюцентрифугирования удается осадить конденсированный хроматин из гомогенатовядер, отделив его тем самым от диффузного хроматина, обладающего высокойтранскрипционной активностью. Фракции активного хроматина обладают рядомхарактерных свойств: повышенной чувствительностью к нуклеазам, повышеннымуровнем модификации гистонов (особенно ацетилированием гистона HI), повышенным содержаниемнекоторых негистоновых белков.

Биохимическиеданные показывают, что во время транскрипции часть нуклеосомных белков остаетсясвязанной с ДНК. Нуклеосомы как частицы видны на хроматиновых фибриллах как доместа отхожде-ния транскрипта, так и после него при редкой посадкеРНК-полиме-разы — фермента, вдвое большего, чем нуклеосома. При частой посадкеэтого фермента (например, при транскрипции рибосомных генов или генов в другихактивных локусах) частицы РНК-полимеразы располагаются тесно друг к другу имежду ними нуклеосомы не видны (см, рис. 101). Вероятнее всего, нуклеосомныебелки при прохождении РНК-полимеразы не теряют связи с ДНК, а сама ДНК всоставе нуклеосомы разворачивается. Предлагаются два варианта измененияструктуры нуклеосом при синтезе РНК. При одном их них нуклеосома «расщепляется»на две полунуклеосомы, а ДНК разворачивается; при другом — нуклеосома, частичнодекомпактизируясь, сохраняет тетра-мер (НЗ-Н4)2, а два димераН2А-Н2В временно отходят, а затем, после прохождения РНК-полимеразы,возвращаются, при этом восстанавливается исходная нуклеосома.

Второйуровень компактизации ДНК — фибрилла диаметром 30 нм

Такимобразом, первый, нуклеосомный, уровень компактизации хроматина играет какрегуляторную, так и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНКприблизительно в 6—7 раз.

Однако вомногих электронно-микроскопических исследованиях было показано, что как вмитотических хромосомах, так и в интерфазных ядрах выявляются фибриллыхроматина диаметром 30 нм (рис. 57, в и 62). Хроматиновые фибриллытакого диаметра были видны как на ультратонких срезах после фиксации глутаровымальдегидом, так и на препаратах выделенного хроматина и выделенных хромосом врастворах, содержащих хотя бы низкие концентрации двухвалентных катионов.Показано, что фибрилла хроматина диаметром 30 нм может обратимо менять свойдиаметр: становится фибриллой толщиной 10 нм, если препараты хроматинаперевести в деионизованную воду или в растворы, содержащие хелатон ЭДТА. В тоже время даже частичная экстракция гистона Н1 переводит исходные фибриллыхроматина (30 нм) в нити диаметром 10 нм, имеющие типичный нуклеосомный уровеньорганизации. При добавлении к ним гистона Н1 восстанавливается первоначальныйдиаметр фибрилл.

Все этоговорило о том, что нуклеосомные цепочки хроматина каким-то специфическимобразом уложены так‚ что возникает не хаотическая агрегация нуклеосом‚ аправильная нитчатая структура диаметром 30 нм.

Относительнохарактера упаковки нуклеосом в составе фибриллы хроматина диаметром 30 нмсуществуют, по крайней мере, две точки зрения. Одна из них защищает такназываемый соленоидный тип укладки нуклеосом. Согласно этой модели, нить плотноупакованных нуклеосом диаметром 10 нм образует в свою очередь спиральные виткис шагом спирали около 10 нм. На один виток такой суперспирали приходится шестьнуклеосом (см. рис. 62). В результате такой упаковки возникает фибрилла спиральноготипа с центральной полостью, которая иногда на негативно окрашенных препаратахбывает видна как узкий «канал» в центре фибриллы. При частичном разворачивании,декомпактизации такой фибриллы и нанесении ее на подложку хорошо видно«зигзагообразное» расположение нуклеосом вдоль фибриллы. Считается, что гистон HI обеспечиваетвзаимодействие между соседними нуклеосомами, не только сближая и связывая ихдруг с другом, но и способствуя образованию кооперативной связи междунуклеосомами, благодаря чему возникает довольно плотная спираль из фибриллыдиаметром 10 нм. Удаление, даже частичное, гистона HI вызывает переходфибриллы диаметром 30 нм в фибриллу диаметром 10 нм, а при полном удалении егопроисходит разворачивание последней в структуру типа «бусин на нити». Такойсоленоидный тип упаковки ДНК приводит к плотности упаковки, равнойприблизительно 40 (т.е. на каждый микрометр нити приходится 40 мкм ДНК). Этипредставления получили подтверждение при анализе структуры хроматина с помощьюдифракции рентгеновских лучей и нейтронов. Здесь необходимо отметить, чтопредставление о соленоидном типе укладки получено из анализа вторичноконденсированного хроматина. Вначале были получены препараты хроматина вприсутствии ЭДТА или выделялись в растворах низкой ионной силы в присутствииионов магния. Во всех этих случаях первоначально хроматин деконденсировался доуровня «бусин на нити», где отсутствует или дестабилизируется контакт междунуклеосомами.

Если жеисследовать хроматин в составе ядер или в виде выделенных препаратов, но приподдержании определенной концентрации двухвалентных катионов (не ниже 1мМ), томожно видеть дискретность в составе фибрилл хроматина диаметром 30 нм: онасостоит как бы из сближенных глобул того же размера — из нуклеомеров. Взарубежной литературе такие 30-нанометровые глобулы, иди нуклеомеры, получилиназвание сверхбусин («супербиды») (см. рис. 57, в и 62). Обнаружено, что если вусловиях, когда нуклеомерная структура фибрилл хроматина сохраняется, препаратыхроматина подвергнуть нук-леазной обработке, то часть хроматина растворяется.При этом в раствор выходят частицы, имеющие размер около 30 нм, с коэффициентомседиментации, равным 45S, в растворах, содержащих 1 мМ магния. Если такие выделенные нуклеомеры обработать ЭДТА, удалить ионы магния, то ониразворачиваются в нуклеосомные цепочки, содержащие 6—8 нук-леосом. Такимобразом, в состав одного нуклеомера входит отрезок ДНК, соответствующий 1600парам оснований, или 8 нуклеосомам.

Компактностьнуклеомера зависит от концентрации ионов магния и наличия гистона HI. Негистоновые белки вконформационных превращениях нуклеомеров не участвуют.

Итак,основная фибрилла хроматина диаметром 30 нм представляет собой линейноечередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК (см. рис. 62).Вероятно, гистоны HI, находясь в центральной зоне этой крупной частицы ивзаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность. В пользу этогоговорят данные о кооперативном связывании гистонов HI в группе по 6—8 молекул.

Противоречиемежду соленоидной и нуклеомерной моделями упаковки нуклеосом в составе фибриллхроматина может быть снято, если принять модель нерегулярного соленоида: числонуклеосом на виток спирали не является строго постоянной величиной, что можетпривести к чередованию участков с большим или меньшим числом нуклеосом навиток.

Нуклеомерныйуровень укладки хроматина обеспечивает 40-кратное уплотнение ДНК, что важно нетолько для достижения целей ком-пактизации гигантских молекул ДНК.Компактизация ДНК в составе фибрилл хроматина диаметром 30 нм может налагатьдополнительные функциональные ограничения. Так, обнаружено, что в составефибриллы хроматина диаметром 30 нм ДНК становится практически недоступной длявзаимодействия с таким ферментом, как метилаза ДНК. Кроме того, резко падаетспособность хроматина связываться с РНК-полимеразой и рядом регуляторныхбелков. Таким образом, второй уровень компактизации ДНК может играть рольфактора, инакти-вирующего гены.

В заключениенеобходимо еще раз напомнить, что как нуклеосомный, так и нуклеомерный(супербидный) уровни компактизации ДНК хроматина осуществляются за счетгистоновых белков, которые участвуют не только в образовании нуклеосом, но и вих кооперативном объединении в виде фибрилл ДНП, где ДНК претерпевает дополнительнуюсверхспирализацию. Все остальные уровни компактизации связаны с дальнейшимхарактером укладки фибрилл диаметром 30 нм в новые ком-пактизационные уровни,где ведущую роль играют негистоновые белки.

еще рефераты
Еще работы по биологии