Реферат: Ферменты

Ферменты

Возможностьпроведения различных манипуляций с ДНК in vitroвсецело зависит от наличия очищенных ферментов, которые специфическим образомразрезают, модифицируют и соединяют молекулы. В настоящее время отсутствуютчисто химические методы, с помощью которых можно было бы осуществлятьперестройку молекул ДНК с такими селективностью и разнообразием, которыехарактерны для ферментативных реакций. В то же время даже с помощью довольнонебольшого числа ферментов можно получать рекомбинантные молекулы ДНК.Большинство этих ферментов были открыты при обстоятельствах, не связанных с ихиспользованием при манипулировании с молекулами ДНК. На самом деле каждыйфермент играет важную роль катализатора в том или ином химическом процессе,протекающем в организме, из которого он выделен. Использование ферментов вкачестве инструмента при манипулировании с ДНК зависит, в частности, от ихдоступности и стабильности, а особенно от их чистоты, и прежде всего от того,свободны ли они от примесей, влияющих на ферментативную активность.

Разныеэкзонуклеазы расщепляют цепь предпочтительно либо с 5'-, либо с 3'-конца, ноиногда они не проявляют такой специфичности. Эндонуклеазам свободные концы нетребуются, поэтому данные ферменты могут гидролизовать кольцевые молекулы ДНК.Разрезание осуществляется по внутренним фосфодиэфирным связям, при этомобразуются фрагменты разной длины. С помощью экзонуклеаз тоже могутобразовываться короткие полинуклеотидные фрагменты, однако конечным продуктомво многих случаях являются нуклеозидмонофосфаты, поскольку экзонуклеазыосуществляют гидролиз, отщепляя последовательно один остаток за другим.

Наконец,нуклеазы отличаются одна от другой по тому, с какой стороны от межнуклеотидногофосфодиэфирного мостика осуществляется гидролиз. Одни ферменты делают разрезмежду фосфатом и 3'-гидроксильной группой с образованием 5'-фосфомоноэфирныхпродуктов, другие – между фосфатом и 5'-гидроксильной группой.

Нуклеазы

а. Общие свойства

Нуклеазыпозволяют специфическим образом модифицировать молекулы ДНК и РНК. Каждыйфермент может быть отнесен к тому или иному классу в соответствии с егоспецифичностью или типом реакции, которую он катализирует. Так, ряд ферментов,подобно рестриктирующим эндонуклеазам, действует только на ДНК. Другие, подобнопанкреатической РНКазе, гидролизуют только РНК. Есть ферменты, которыеиспользуют в качестве субстратов как ДНК, так и РНК. Одни нуклеазыпредпочтительно действуют либо на двухцепочечные, либо на одноцепочечныеполинуклеотидные субстраты, другие не проявляют такой выраженнойпредпочтительности.

Нуклеазыможно также разделить на две следующие категории: экзонуклеазы иэндонуклеазы.

Большинствоферментов упоминаются в тексте этой книги. Нуклеазы, отмеченные звездочкой,используются как рутинные реактивы в экспериментах по получению рекомбинантныхмолекул ДНК и поэтому рассматриваются более детально.

б. Нуклеазы,специфичные в отношении одноцепочечной ДНК

Эндонуклеазы.Некоторые эндонуклеазы гидролизуют одноцепочечные молекулыДНК примерно в тысячу раз быстрее, чем двухцепочечные. Такая специфичностьиспользуется во многих экспериментах – при конструировании рекомбинантных ДНК,при гетеродуплексном анализе и даже при анализе экспрессии генов. Некоторыереакции, катализируемые подобными эндонуклеазами.

Несколькоразных эндонуклеаз такого типа были достаточно хорошо очищены иохарактеризованы, чтобы их можно было использовать в качестве реактивов. Однаиз них, нуклеаза S1,получена из высушенных препаратов плесневого гриба Aspergillus oryzae; источникамидвух других широко используемых ферментов являются Neurospora иMung beans. Каждый из этих трехферментов проявляет максимальную активность и точность распознаванияодноцепочечных и двухцепочечных молекул при определенных условиях. Все трифермента гидролизуют как ДНК, так и РНК. При разрыве фосфодиэфирных связей спомощью этих ферментов образуются 5'-монофосфатные и З'-гидроксильные концы.

Экзонуклеазы.Экзонуклеаза E.coli exo VIIспецифична в отношении одноцепочечных ДНК. Она обладает необычнойэкзонуклеазной активностью в том смысле, что инициирует отщепление как с 5'-,так и с З'-концов цепи, в то время как наиболее известные экзонуклеазыспецифичны к какому-то одному концу. Продуктами гидролизаотдельных цепей экзонуклеазой ехо VIIявляются олигонуклеотиды длиной примерно 25 мономерных единиц, которые содержат5'-фосфомоноэфирные концевые группы.

в. Нуклеаза Bal 31

ПсевдомонадаAlteromonas espejiana секретируетединственную дезоксирибонуклеазу, получившую название Bal 31.В отношении одноцепочечной ДНК, в том числе одноцепочечных участковдвухцепочечной ДНК, Bal 31 ведет себя как эндонуклеаза, действуяаналогично другим эндонуклеазам, специфичным к одноцепочечным ДНК. Однако вотношении интактной двухцепочечной ДНК этот фермент проявляет экзонуклеазнуюактивность, по-видимому, благодаря тому, что он способен распознавать локальныеодноцепочечные участки. Bal 31 разрезает обе цепи на обоих концахдуплекса, т.е. осуществляет деградацию одновременно в направлениях 3' – >5'и 5'–>3'. В результате двухцепочечная молекула постепенно укорачивается.Если эмпирически оценить скорость этого процесса, то с помощью фермента Bal 31можно получать фрагменты ДНК нужной длины. Хотя укорочение разных молекул ДНКпроисходит несинхронно, получается набор фрагментов, длина которых близка кзаданной. В результате исчерпывающего гидролиза с помощью Bal 31промежуточные олигонуклеотидные продукты расщепляются до 5'-мононуклеотидов.

г. РНКазы Н

Существуетгруппа ферментов, получивших название РНКазы Н потому, что они специфическирасщепляют цепь РНК в гибридном дуплексе РНК-ДНК. РНКаза Н E. coli представляет собой эндонуклеазу,продуктами действия которой являются олигорибонуклеотиды с 5'-фосфомоноэфирнымиконцами. Этот фермент широко используется как реактив. Клетки эукариот тожесодержат подобную эндонуклеолитическую РНКазу Н. РНКаза Н-экзонуклеолитическаяактивность присуща экзонуклеазе III E.coli иобратным транскриптазам, кодируемым ретровирусами. Экзонуклеаза III расщепляет РНК до5'-нуклеозид-монофосфатов в направлении З'–>5', а продуктами гидролиза цепиРНК с помощью обратной транскриптазы являются 5'-фосфорилированныеолигорибонуклеотиды длиной от двух до десяти нуклеотидов.

Эндонуклеазырестрикции

Эволюциянаделила различные виды бактерий уникальными эндонуклеазами, позволяющими имотличать их собственную ДНК от чужеродной. Тем самым природа снабдила ученыхбогатым набором высокоспецифичных реактивов для расщепления ДНК. При изученииДНК большое значение имеют две важные особенности рестриктирующих эндонуклеаз. Перваясвязана с замечательной способностью фермента узнавать специфические короткиенуклеотидные последовательности в ДНК. Вторая состоит в том, что существуетбольшое количество различных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых узнаетспецифическую последовательность.

а. Три типаэндонуклеаз рестрикции

Эндонуклеазытипов I и И. Ферменты, относящиеся к группеэндонуклеаз типов I и II, – это сложные белки, обладающие активностямирестриктирующей эндонуклеазы и метилазы. Эти интересные ферменты неиспользуются, однако, при конструировании рекомбинантных молекул ДНК. Ферментытипа I связываются с ДНК вспецифических участках и затем производят двухцепочечные разрезы на разномрасстоянии от сайтов узнавания, варьирующем от 400 п.н. до 7 т.п.н. Дляосуществления ферментативного гидролиза ДНК необходимы Mg2+,ATP и S‑аденозилметионин. Последнийактивирует фермент. Разрезание сопровождается гидролизом АТР, при этом ферментутрачивает эндонуклеолитическую активность, но сохраняет АТРазную. Такимобразом, эндонуклеазы типа Iявляются ДНК-зависимыми АТРазами. Кроме того, они представляют собойсайтспецифические метилазы, катализирующие образование 6‑метиладениновыхостатков в сайте узнавания. Например, сайтом узнавания для фермента из E. coli K12является

5'-AACNNN NN N GTGC‑3' 3‑TTGNNNNNNCACG‑5'

гдеN – любое основание, aN‑комплементарное ему основание. Эндонуклеаза разрезает цепь назначительном расстоянии от сайта узнавания, но при этом метилирование собразованием 6‑метил-аденина происходит в пределах этого сайта.Эндонуклеазная активность проявляется только при наличии полностьюнеметилированного сайта. Сайт узнавания для фермента E. coli K12состоит из двух коротких специфических олигонуклеотидов, разделенныхшестью-восемью неспецифическими парами оснований. Такая структура типична длясайтов узнавания ферментов типа I,обнаруженных у различных штаммов бактерий. Специфические олигонуклеотидныепоследовательности для разных ферментов различаются, но метилированные остаткиА всегда находятся в одинаковых позициях.

Родственныесистемы рестрикции-модификации типа Iкодируются аллельными локулами геномов различных кишечных бактерий.С каждой системой связаны три сцепленных гена: hsdR, hsdM и hsdS,расположенные в порядке, соответствующем порядкутранскрипции. Полипептидные продукты hsdM и hsdS транслируются с одной двухцистронной мРНКи вместе составляют метилазу. Первый из них обладает метилазной активностью, авторой осуществляет сайтспецифическое узнавание. Продукт гена hsdR обладаетэндонуклеазной активностью. Все три полипептида содержатся в различныхпропорциях в активных препаратах ферментов типа I.

Ферментытипа III, так же как иэндонуклеаза типа I,обладают нуклеазной и метилазной активностями. Однако, несмотря на то, чтоферменты типа III активируются S‑аденозилметиониноми для своей работы требуют АТР, они не катализируют ее гидролиза. Эндонуклеазытипа III делают двухцепочечныеразрезы в ДНК на расстоянии примерно 25 п.н. от своих сайтов узнавания. Вприсутствии АТР и S‑аденозилметионинате же ферменты катализируют сайтспецифическое метилирование. Ферменты типа III‑гетеродимерныебелки. Их субъединицы кодируются двумя сцепленными генами, локализованными унекоторых штаммов Е. coli во внехромосомных геномах. Каждый такойген представляет собой отдельную транскрипционную единицу. Один генный продуктузнает специфическую последовательность и обладает метилазной активностью,другой выполняет эндонуклеазную функцию.

Посколькуферменты типа I не разрезают молекулы ДНК на репродуцирующиеся фрагменты иэндонуклеазные активности ферментов типа Iи III конкурируют сметилированием, ни один из них не используется в качестве реагента при получениирекомбинантных ДНК.

Эндонуклеазытипа II. Рестриктирующие эндонуклеазы типа II являются основным инструментом приконструировании рекомбинантных молекул ДНК и при анализе структуры ДНК. Этиферменты способны узнавать специфические короткие нуклеотидныепоследовательности и связываться с ними, но в отличие от эндонуклеаз типов I и IIIони производят двухцепочечные разрезы по специфическим фосфодиэфирным связямлибо в пределах самого сайта узнавания, либо на вполне определенном небольшомрасстоянии от него. Один и тот же фермент разрезает данную молекулу ДНК собразованием одинаковых наборов фрагментов. Длина фрагментов определяетсярасстоянием между специфическими последовательностями, узнаваемыми этимферментом. Ферменты типа II гидролизуют фосфодиэфирные связи между3'-гидроксильной группой и фосфатом, в результате чего образуется5'-фосфомоноэфирная группа с одной стороны от разрыва и 3'-гидроксильная группа– с другой.

Сайт узнавания и разрезания длярестриктирующей эндонуклеазы Eco RI.Разрезание происходит в два этапа: сначала гидролизуется одна цепь, потом – другая.При обычных условиях продуктами реакции являются два дуплексных фрагмента скомплементарными одноцепочечными концами. В условиях, способствующихстабилизации водородных связей между четырьмя нуклеотидами из разных цепей,фрагменты могут реассоциировать.

б. Типичнаярестриктирующая эндонуклеаза типа II

ЭндонуклеазаEco RI. Широко используемая рестриктирующаяэндонуклаза Eco RIразрезает ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'-GAATTC‑3'. Как и в случаедругих рестриктирующих эндонуклеаз типа II,эта последовательность является палиндромом,т.е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятсяодинаковые последовательности, читаемые в направлении 5'–>3'. Eco RI гидролизует фосфодиэфирные связи междуостатками Gи А в каждой цепи. Поскольку эндонуклеаза Eco RI разрезает обе цепи в том месте, гдевстречается палиндромная последовательность 5'-GAATTC‑3', молекула ДНКразрезается на характерный для нее набор фрагментов.

Липкиеконцы. Эндонуклеаза Eco RI производит ступенчатые двухцепочечныеразрезы, при этом у образующихся фрагментов ДНК на концах образуются короткиекомплементарные одноцепочечные хвосты из четырех оснований – 5'-ААТТ‑3'.В зависимости от ионной силы раствора и температуры эти комплементарные хвостылибо остаются спаренными, либо денатурируют, и тогда образуются отдельныефрагменты с короткими одноцепочечными выступами на 5'-концах. Присоответствующих условиях комплементарные хвосты воссоединяются. Одноцепочечныеконцы, образующиеся при расщеплении ДНК эндонуклеазой Eco RI, получили название липких, посколькуони способны спариваться друг с другом. Важным следствием образованияступенчатых разрывов является то, что фрагменты, получающиеся в результатеобработки эндонуклеазой Eco RIдвух разных ДНК, могут соединяться с помощью липких концов. При этом различия,затрагивающие двухцепочечные спиральные сегменты указанных ДНК, на процесссоединения не влияют.

Фермент.В отличие от рестриктирующих эндонуклеаз типов I и IIIферменты типа II,подобные Eco RI,не катализируют метилирования. Метилазную активность проявляет другой белок.Активная эндонуклеаза Eco RIпредставляет собой димер, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей смол. массой 31000. Исходя из гомодимерной структуры можно было бы ожидать, чтофермент будет действовать симметрично на идентичные последовательности двухчастей сайта узнавания и разрезать обе цепи одновременно. Однако на самом делегидролиз происходит последовательно.

Белоквзаимодействует с участком около десяти пар оснований; шесть из них находятся впределах сайта узнавания, остальные являются фланкирующими. Именно этифланкирующие последовательности, по-видимому, определяют выбор цепи, котораябудет разрезана первой. Кроме того, фланкирующие пары оснований влияют на общуюскорость разрезания в данном сайте узнавания, так что в разных сайтах одноймолекулы ДНК гидролиз осуществляется с разной скоростью. Были полученыкристаллы комплекса Eco RIи олигонуклеотида 5'-TCGCGAATTCGCG‑3'и проведен их рентгеноструктурный анализ. Это позволило в деталях выяснитьспособ взаимодействия данного фермента и ДНК. Было установлено, что между двумяостатками аргинина и одним глутаматом, с одной стороны, и парами оснований всайте узнавания ‑ с другой, образуются водородные связи, в результатечего происходит частичное раскручивание В-ДНК. О свойствах другихрестриктирующих эндонуклеаз типа IIизвестно значительно меньше, но, по-видимому, они аналогичны свойствам Eco RI.

в. Различные группырестриктирующих эндонуклеаз типа II

Большойкаталог реактивов. У всех ферментов обнаружено около 90разных сайтов узнавания. Каждый из ферментов получен из определенногопрокариотического организма, что и отражено в его названии. Так, Eco RI ведет свое происхождение из штамма Escherichia coli К12;Hae IIи HaeIII – из Haemophilus aegyptius; Bam HI –из Bacillus amyloliquefaciens штамма H; Mbo Iи Mbo II –из Moraxella bovis и т.д. Два разных фермента, имеющиеодинаковые сайты узнавания, называются изошизомерами.Однако изошизомеры не обязательно делают разрез в одном и томже месте; сравните, например, Xma I и Sma I.

Палиндромныесайты узнавания и разрезания. Эндонуклеаза Eco RI –одна из многих рестриктирующих эндонуклеаз типа II, которые узнают различные палиндромные нуклеотидныепоследовательности и делают разрезы, в результате чего образуются фрагменты скомплементарными одноцепочечными хвостами. В пределах этой группы можновыделить несколько разновидностей ферментов. Например, Eco RI, Hind IIIи некоторые другие эндонуклеазы узнают последовательности из шести пароснований; эндонуклеаза Hinf Iузнает пять пар оснований, из которых центральным остатком может быть любой изчетырех нуклеотидов. Эднонуклеаза Bgl Iузнает шесть специфических нуклеотидных остатков, но они должны быть разделеныв середине любыми другими пятью парами оснований. Эндонуклеаза Not I имеет сайт узнавания протяженностьювосемь пар оснований; такие ферменты, как Taq I и Mbo I,имеют сайты узнавания из четырех нуклеотидов. Другая известная особенностькасается свойств одноцепочечных концов, образующихся при действии различныхрестриктирующих эндонук-леаз. Эндонуклеазы Eco RI, Hind III, Mbo I и Оа I образуют одноцепочечные хвосты, состоящиеиз 5'-концевых остатков каждой цепи, а эндонуклеазы Pst Iи Hae II– из 3'-остатков.

Эндонуклеазы,имеющие различные сайты узнавания и разрезания, часто образуют идентичныелипкие концы. Например, под действием эндонуклеаз Mbo I, Bcl I и Bam HIобразуются 5'-концевые 5'-GATC‑3'.В результате фрагменты, получающиеся при расщеплении данной ДНК любым из этихферментов, при смешивании и отжиге будут соединяться друг с другом. Однакофрагменты, получающиеся из различных ДНК при разрезании эндонуклеазой Bgl I, вряд ли будут соединяться при отжиге,поскольку одноцепочечные хвосты могут содержать любую последовательность изтрех нуклеотидов.

Другиерестриктирующие эндонуклеазы типа II также узнают специфические палиндромныенуклеотидные последовательности, но разрезают фосфодиэфирный мостик в серединеузнаваемой последовательности, в результате чего образуются фрагменты ДНК с тупыми двухцепочечнымиконцами.

Непалиндромныесайты узнавания с разрезанием на некотором расстоянии от них. Ферментытипа II, но другой разновидности тоже узнают специфические нуклеотидныепоследовательности, но гидролизуют фосфодиэфирные мостики вне этихпоследовательностей. При этом узнаваемая последовательность не являетсяпалиндромом. В этих случаях рестриктирующие эндонуклеазы, по-видимому,«отсчитывают» точное число пар оснований от узнаваемой последовательности изатем разрезают цепи. Механизм отсчета таков, что места гидролиза разных цепейсмещены одно относительно другого на один нуклеотид. В результате образуютсяфрагменты ДНК с одноцепочечными выступами длиной только в один нуклеотидныйостаток.

г. Картированиесегментов ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз типа II

Спомощью рестриктирующих эндонуклеаз можно разрезать сложные геномы или длинныесегменты ДНК на воспроизводимые наборы более мелких единиц. В свою очередьтакие единицы можно разделить по размерам с помощью нескольких методов. Чащевсего для этого используют электрофорез фрагментов ДНК в полужидком геле,приготовленном на основе агарозы или полиакриламида. Обычно подвижностьдвухцепочечного фрагмента в электрическом поле обратно пропорциональналогарифму его размера. Используя в качестве маркеров фрагменты известной длины,легко определить размер интересующего нас фрагмента с помощью линейки ипростого графика. Для проведения такого анализа обычно достаточно менее 1 мкгДНК, поскольку фрагменты легко выявляются при окрашивании соответствующимкрасителем, например бромистым этидием.

Наборфрагментов, получающихся при расщеплении ДНК определенной рестриктирующейэндонуклеазой, является своеобразным «отпечатком пальцев» этой ДНК. Определяя,какие фрагменты образуются при расщеплении ДНК несколькими рестриктазами поотдельности и в разных комбинациях, часто удается установить порядокрасположения сегментов в исходной молекуле, т.е. построить физическую картуДНК, где указано положение каждого сегмента. Сложные геномы или большиемолекулы ДНК дают при обработке рестриктирующими эндонуклеазами сложные наборыфрагментов, и для их анализа используют специальные компьютерные программы.

д. Защита ДНКпосредством метилирования

Родственныеметилазы. Геномы бактерий, кодирующие рестриктирующиеэндонуклеазы, защищены от самодеградации с помощью специфических системмодификации. Метилазы, осуществляющие специфическую модификацию, узнают те женуклеорестрикции в ДНК проявляют устойчивость к действию определенныхэндонуклеаз. Например, в ДНК позвоночных часто встречаются динуклеотиды 5'-meCG‑3'. Если сайт рестрикцииэндонуклеазы Hpa IIсодержит такой метилированный динуклеотид, то фермент не может разрезать ДНК вэтом месте. Этот факт используется для определения в сложных геномах состоянияметилирования таких динуклеотидов 5'-CG‑3',которые находятся в сайтах узнавания Hpa II.Несмотря на неспособность эндонуклеазы Hpa IIразрезать динуклеотид 5'-CmeCGG‑3',ее изошизомер, эндонуклеаза Msp I,осуществляет такое разрезание. Сравнивая чувствительность фрагментов ДНК к двумуказанным ферментам, можно локализовать метилированный цитозин на карте.Подобным же образом часто встречающуюся в ДНК растений последовательность5'-СmеСTAGG‑3' можно отличить от неметилированнойформы, 5'-СС‑3', если сравнить продукты, получающиеся при расщеплении ДНКс помощью изо-шизомеров Bst NIи Eco RII.

Независимыеметилазы E.coli. Привключении фрагментов эукариотической ДНК в бактериальные векторы и ихрепликации в клетках Е. coli илидругих прокариот характерный для них тип метилирования утрачивается и ониметилируются способом, специфичным для новой клетки-хозяина. Например, вклетках Е. coli динуклеотиды 5'-CG‑3' не метилируются, и в результатесайты, ранее защищенные от действия эндонуклеазы Hpa II, становятся чувствительными к ней. Однакодва обычных фермента E.coli: dam ДНК-метилтрансфераза,которая метилирует остаток А в последовательности 5'-GATC‑3', и dcm ДНК-метилтрансфераза,метилирующая остаток С в последовательности 5'-СС‑3', – образуютновые устойчивые сайты; ни одна из этих метилаз не является частью системырестрикции-модификации. Кроме того, эукариотическая ДНК, реплицированная в E. coli,становится устойчивой к эндонуклеазам Mbo I и Bcl Iблагодаря тому, что в пределах их сайтов узнавания находится 6‑метиладенин.Заметим, что тот же самый 6‑метиладенин в сайте 5'-GATC‑3' не мешает работе эндонуклеаз Bam HI, Bgl I или Sau 3А;однако разрезание с помощью Sau 3А блокируется, если метилирован остатокС.

Фосфомоноэстеразы

Частопри проведении экспериментов с рекомбинантными ДНК или при анализе структурыДНК приходится отщеплять концевые фосфомоноэфирные группы. Известно множествонеспецифических фосфомоноэстераз. Эти ферменты, выделенные из клеток Е.coli икишечника теленка, были получены в высокоочищенном виде. Фосфатазы гидролизуюткак 5'-, так и 3'-концевые фосфомоноэфиры в ДНК и РНК.

Фосфомоноэфирныегруппы, находящиеся на конце одноцепочечных разрывов в дуплексной ДНК илиэкранированные нависающей над ними второй цепью, подобные тем, которыеобразуются при разрезании эндонуклеазой Pst I,удаляются с помощью фосфатазы только при слабоденатурирующих условиях.

Полинуклеотидкиназа

Киназысоставляют большой класс ферментов, катализирующих фосфорилирование многих биохимическихсоединений – от небольших молекул до очень крупных макромолекул, включаяполипептиды и полинуклеотиды.

Полинуклеотидкиназа,широко используемая в качестве реактива в экспериментах с рекомбинантными ДНК,была выделена и очищена из клеток E.coli, инфицированныхбактериофагом Т4. Фермент кодируется геномом бактериофага. Донором фосфатаслужит АТР, а одним из продуктов реакции является ADP. В ходе реакции специфическифосфорилируются 5'-концевые гидроксильные группы молекул ДНК и РНК; 3'-концевыегидроксильные группы не фосфорилируются. Одной из важных сфер примененияполинуклеотидкиназы является мечение 5'-конца полинуклеотидной цепи с помощьюрадиоактивного 32Р с использованием АТР, меченной по у-фосфату.Последовательное действие фосфатазы и полинуклеотидкиназы приводит к замещениюнемеченого 5'-концевого фосфомоноэфира на радиоактивный без каких-либо другихизменений в цепи.

ДНК-лигаза

Получениерекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегментов ДНК из различных источников.Благодаря тому, что при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами образуютсяфрагменты с липкими концами, при отжиге эти фрагменты довольно легкосоединяются, однако водородные связи, удерживающие их вместе, в обычныхусловиях оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для ковалентногосшивания фрагментов используют ДНК-лигазу, которая катализирует образованиефосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами.

Чтобылигирование было успешным, в объединяемых цепях должен произойти отжигкомплементарных концов; в этом случае происходит лигирование обеих цепей. Еслидва одноцепочечных сегмента удерживаются рядом за счет образования водородныхсвязей с интактной комплементарной цепью, то образование фосфодиэфирной связипроисходит только в одной цепи. ДНК-лигаза фага Т4 способна также соединитьдвухцепочечные молекулы с тупыми концами, катализируя образованиефосфо-диэфирных связей в обеих цепях.

Цепиудлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру сосвободной 3'-гид-роксильной группой; выбор нуклеотидного остатка на каждомэтапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I E. coli катализирует и некоторые другие важныереакции. Две из них имеют особое значение для экспериментов с рекомбинантнымиДНК: это 3'–>5'- и 5'–>3'-экзонуклеазные реакции. В обоих случаяхобразуются продукты с 5'-фосфомоноэфирными концами. Две указанныеэкзонуклеазные активности присущи разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белокпротеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3'–>5'-экзонуклеазнаяи полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащимкарбоксильную группу на конце, а 5'–>3'-экзонуклеазная активность – совторым, более мелким фрагментом.

б. Никтрансляция

Реакции,катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение. Например, частоиспользуется способность ДНК-полимеразы Iкатализировать одновременно как полимеризацию, так и 5'–>3'-экзонуклеазноерасщепление. Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградациюцепи в 5'–>3'-направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши вдвухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путемпоследовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. Собственно синтеза ДНК непроисходит: брешь лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется названиеэтого процесса – никтрансляция. Проводяниктрансляцию в присутствии а-32Р-меченныхдезоксинуклеозидтрифосфатов, в качестве субстратов получают меченые фрагментыДНК с высокой удельной активностью.

в. Заполнение брешей

ДНК-полимеразаспособна превращать фрагменты ДНК с липкими концами во фрагменты с тупымиконцами при наличии выступающего 5'-конца. 3'-гидроксильный конец служитпраймером, 5'-выступ – матрицей; пробел на 3'-конце заполняется путемпоследовательного присоединения дезоксинуклеотидных остатков. Для заполнениялучше использовать большой карбоксиконцевой фрагмент ДНК-полимеразы I, получаемый в результате протеолиза; этопозволяет избежать 5'–>3'-экзонуклеазного расщепления матрицы. Липкие концыможно превратить в тупые и с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нуклеазы,однако в этом случае утрачивается несколько нуклеотидных остатков.

РНК-зависимыеДНК-полимеразы

Этиферменты были выделены из РНК-содержащих опухолеродных вирусов. Они позволяютсинтезировать ДНК на РНК-матрице in vitro.Реакция, катализируемая обратными транскриптазами, аналогична стандартнымреакциям с участием ДНК-полимераз и, как в случае с другими ДНК-полимеразами,нуждается в затравке. В качестве матрицы обычно используется одна цепь РНК, накоторой синтезируется комплементарная цепь ДНК. В результате образуетсягибридная молекула РНК–ДНК. Часто удобным праймером служит короткая цепочкаполидезоксириботимидиловой кислоты, поскольку она способна спариваться сполирибоаде-ниловой кислотой, обычно находящейся на концах эукариотических мРНК;в результате такого спаривания инициируется синтез ДНК-копии этой РНК.

кДНК-копиямолекулы мРНК может быть превращена в двухцепочечную ДНК. Для этого, преждевсего, с помощью РНКазы Н или щелочного гидролиза удаляют исходную матричнуюРНК. Оставшаяся одноцепочечная кДНК служит собственным праймером при синтезевторой комплементарной цепи ДНК. Как это происходит, не совсем ясно. Последняяреакция может катализироваться либо ДНК-полимеразой I, либо обратной транскриптазой.По-видимому, праймером служит короткая шпилечная структура, образующаяся вблизи3'-гидроксильного конца первой цепи. Конечный дуплекс все еще содержит шпилькуна одном из концов, которая разрезается специфичной в отношении одноцепочечнойДНК нуклеазой с образованием двух полностью комплементарных цепей ДНК.

Терминальнаядезоксинуклеотидил-трансфераза

а. Полимеризация безматрицы

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза являетсяв определенном смысле полимеразой, поскольку она катализирует синтезполидезоксирибо-нуклеотидов из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с высвобождениемнеорганического пирофосфата. Подобно ДНК-полимеразам, она не способнаинициировать синтез новой полимерной цепи и поэтому требует присутствияпраймера со свободной концевой 3'-гидроксильной группой. Однако в отличие отистинных ДНК-полимераз она не нуждается в матрице и не способна что-либокопировать вообще. Продукт полимеризации соответствуетдезокси-нуклеозидтрифосфатам, используемым в качестве субстрата. Если в реакцииучаствует dATP,то продуктом является полидезоксиадениловая кислота, находящаяся на 3'-концепраймера; если используется dGTP,то к праймеру оказывается присоединенной poly.Поскольку терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не копирует матрицу,продуктом синтеза является одноцепочечный полимер. При использовании в качествепраймера двухцепочечной молекулы на каждом конце дуплекса образуются одинаковые3'-хвосты. На самом деле терминальная дезоксинуклеоти-дилтрансферазапредпочитает одноцепочечные, а не двухцепочечные праймеры. Если имеетсяполностью двухцепочечный фрагмент ДНК, к которому нужно присоединитьодноцепочечные хвосты, можно использовать различные методы полученияодноцепочечных концов, способных служить праймерами.

б. Синтез липкихконцов

Спомощью дезоксинуклеотидилтрансферазы к молекулам ДНК, не имеющим липкихконцов, можно присоединить такие концы. Тупые концы образуются при механическомразрыве больших молекул ДНК, при обработке ДНК с помощью рестриктирующихэндонуклеаз, дающих тупые концы, или при действии неспецифических ДНКаз.Например, если к одному набору фрагментов ДНК присоединить poly, а к другому – poly и смешать эти фрагменты, то произойдет ихсоединение друг с другом. Пробелы, образующиеся из-за неравной длины poly- и ро1уА) – хвостов, могут бытьзаполнены с помощью ДНК-полимеразы I,а концы соединены ДНК-лигазой. Такой подход использовался при конструированиипервой рекомбинантной молекулы ДНК. И хотя открытие рестриктирующих эндонуклеазсильно упростило процедуру получения липких концов при рекомбинации молекул ДНКin vitro, иногда для их создания все ещеиспользуется терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза.

РOLY-полимераза

Подобнотерминальной дезоксинуклеотидил-трансферазе, po1y-полимераза присоединяетнуклеотидные остатки к 3'-концу цепи без участия матрицы. Однако po1y-полимеразапроявляет специфичность в отношении РНК. Праймером является полирибонуклеотид,а субстратом – АТР. При этом GTP,СТР, UTP или dATP не могут заменить ATP. Po1y-полимераза выполняетвысокоспециализированную и важную функцию в экспериментах с рекомбинантнымиДНК: ее используют для присоединения po1y-концов к молекулам РНК при синтезекДНК.