Реферат: Секвенирование (Генная инженерия)
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение…………………………………………………………………………………………3
1. Определениенуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама и Гилберта……………………………………………………………………………………….4
2.Секвенирование ДНК методом полимеразного копирования ( метод Сэнгера) …………8
3.Филогенетический анализ геномов вирусов ………………………………………………15
4. Компьютерныйанализ генетических текстов ……………………………………………..18
Заключение……………………………………………………………………………………..22
Списоклитературы …………………………………………………………………………….23
ВВЕДЕНИЕ.
Разработка методов клонирования и определения последовательности оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положила начало новому этапу развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участковгенома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно применитьдля их исследования целый арсенал новых методов генной инженерии. Эти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.) позволяютмодифицировать участки нуклеотидных последовательностей и исследовать ихфункции на молекулярном уровне. С их помощью комбинируются участкигенетического материала и создаются геномы с совершенно новыми функциями.
Секвенирование нуклеиновых кислот в настоящее время стало рутинным методом молекулярной биологии. Несомненно, в ближайшем будущем появятся ещеболее совершенные автоматические секвенаторы, что приведет к резкомуувеличению числа расшифрованных последовательностей.
Благодаря знанию генетического кода появилась возможность определятьучастки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потенциальные белки. Этотисточник и сегодня дает нам основную информацию о функциональном строениинуклеотидной последовательности.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫММЕТОДОМ МАКСАМА И ГИЛБЕРТА.
Быстрый прогресс,наблюдавшийся в последние годы в различных областях молекулярной биологии, вомногом обусловлен появлением эффективного метода определения первичнойструктуры ДНК. Этот метод, предложенный в 1977 г. Максамом и Гилбертом,основан на селективной химической модификации различных типовгетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидныхсвязей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждомутипу гетероциклических оснований проводятся таким образом, чтобы в каждоймолекуле ДНК в среднем модифицировалось только одно звено данного типа. Посколькувсе звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют смодифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этоготипа окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичнымамином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных гетероциклическихоснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах отщеплениягетероциклов (рис. 1).
Модификации подвергаютДНК, 32Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивнаяметка вводится фосфорилированием с помощью />-32Р-АТРи Т4-полинуклеотидкиназы. Таким образом, в результате химической деградацииполучается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментовсоответствуют положению мономерных звеньев того типа, который подвергалсямодификации. Концевая радиоактивная метка служит точкой отсчета при определениидлины продуктов химической деградации ДНК (рис. 2)
Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, которыйпозволяет разделять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего наодно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читаетсянепосредственно с радиоавтографа геля.
Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточнодлинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16 звенных)оли-годезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае реакции химическоймодификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и температуру реакции)с целью повышения степени модификации.
/>
Рисунок 1.1Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки вторичным аминомили щелочью.
/>
Рисунок 2 Химическаядеградация ДНК.
Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенноготипа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам гуанина – обработкадиметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и гуанина – апуринизация50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по остаткам аденина и цитозина –расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 н. гидроксида натрияи по остаткам тимидина и цитозина – обработка гидразином (рис. 4).
В настоящее время широко используются два основных вариантасеквенирования по Максаму — Гилберту. В первом из них реакции химическоймодификации ДНК проводят в растворе, а во втором ДНК предварительноиммобилизуют на твердой фазе (например, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод болеетрадиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для секвенированияфрагментов ДНК различных размеров, в том числе олигонуклеотидов. В то же времявторой метод имеет ряд преимуществ. Он менее трудоемок и занимает меньшевремени, проще в освоении, позволяет обойтись минимальным набором оборудования.В целом оба метода обеспечивают получение вполне приемлемых результатов, авыбор одного из них определяется конкретными условиями лаборатории.
/>
/>
Рисунок 3 Реакцияселективного расщепления по остаткам гуанина
/>
Рисунок 4 Реакцияселективного расщепления по остаткам тимидина и цитозина.
2. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОГО КОПИРОВАНИЯ.
(МЕТОД СЭНГЕРА)
Ферментативный синтез олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов с помощьюДНК-полимераз, заключающийся в копировании матричного полинуклеотида нашелблестящее применение в качестве одного из двух наиболее эффективных методовустановления первичной структуры ДНК. Метод состоит в получении блоков-копийполидезоксирибонуклеотида, структура которого изучается. При этом обязательнымявляется выполнение двух условий. Во-первых, копирование должно проводиться,начиная с определенного мономерного звена. Во-вторых, синтез копий следуетосуществлять четыре раза, каждый раз останавливая его поочередно на каком-либоодном из четырех мономёрных звеньев (A, G, С или Т), иначе говоря, стремятся получить полный набор«комплементационно отраженных» копий исследуемого полинуклеотида,образование которых прекратилось в каждом из мест расположения одного изчетырех мономерных звеньев нуклеиновой кислоты. Определение длины каждой копиипозволяет установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемогополинуклеотида. Длина копии определяется фракционированием в полиакриламидномгеле. Этот метод, таким образом, так же как и метод, основанный на модификацииоснований позволяет получать информацию о положении определенного мономерногозвена в цепи полинуклеотида прямо после фракционирования.
Для получения копии исследуемого полинуклеотида в последнем выбираютточку отсчета, что достигается введением в систему ферментативного синтеза вкачестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такой олигонуклеотидво всех копиях, образующихся в результате достраивания его ферментативным путем,остается постоянным 5'-концевым фрагментом, т. е. является точкой отсчета. Копированиес помощью ДНК-полимеразы в присутствии всех четырехдезоксирибонуклеозид-5'-пирофосфатов (один из них берется />32Р-меченным)проводят в течение ограниченного времени. Цель этого этапа — проведениестатистически ограниченного синтеза для получения всех возможных копий, начинаяс затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и включая полную копиюизучаемого полинуклеотида. В идеале смесь должна включать все возможныеполинуклеотиды (рис. 5), синтез которых статистически прекращается где-то в серединематричного полинуклеотида в районе ATGCTG матричнойпоследовательности. На практике различные компоненты смеси присутствуют вразных количествах. Если такую смесь далее подвергнуть электрофорезу вполиакриламидном геле в определенных условиях, когда скорость движенияпропорциональна длине цепи, на электрофореграмме обнаруживается серия полос,представляющих различные олигонуклеотиды. Такое фракционирование обычно не проводят, хотя оно может использоваться для контроля на
/>
Рисунок 5 Использованиеферментативного синтеза олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов для определенияпервичной структуры ДНК.
завершающемэтапе анализа. Инкубационную смесь 32Р-меченных олигонуклеотидов различнойдлины в виде комплексов с матричным полинуклеотидом подвергают гель-фильтрациидля удаления дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов и аликвоты реакционной смесиреинкубируют с ДНК-полимеразой в различных условиях. В случае«минус-системы» реинкубацию проводят в присутствии только трехдезоксирибонуклеозид-5'-три-фосфатов. Например, в «- А-системе» отсутствует dATP и каждая копия в смеси достраивается с помощьюДНК-полимеразы до места, в котором следующим мономерным звеном должен бытьостаток pdA (т.е. Т в матричном полинуклеотиде). Образующуюся смесь фракционируютс помощью электрофореза и обнаруживают (ауторадиографически) ограниченноеколичество полос (их количество равно количеству Т в матричном полинуклеотиде).Аналогично проводят копирование в отсутствие других субстратов: — dGTP, — dCTP или — dTTP (- G-,- С- и — Т-системы соответственно). Все четыре ионофорезапроводят в полиакриламидном геле параллельно. Полученные ауторадиограммыпозволяют сразу написать нуклеотидную последовательность, причем чтение цеписнизу вверх соответствует 5'/>3'-полярностицепи копии. Например, положение самого короткого олигонуклеотида (в " — Т-системе") указывает на то, что следующий за ним по длине олигонуклеотидзаканчивается на Т, т. е. что против полосы, расположенной выше (это полоса в - А-системе), следует записать букву Т. Таким же образом записывают далее впоследовательности букву А (на основании положения следующего по длинеолигонуклеотида, который оказался в "- А-системе") и т. д. Соответствующийучасток цепи в матрице читается с учетом принципа комплементарности иантипараллельности цепей в комплексе матрица — затравка. Для проверкиэтих данных используют результаты анализа с помощью «плюс-системы».В этом случае дополнительное копирование (после первого этапа) проводят вприсутствии ДНК-полимеразы, выделенной из бактериофага Т4, которая в отсутствиесубстратов (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляет 3'-экзонуклеазную активность(аналогичную действию ФДЭ змеиного яда), т. е. отщепляет мононуклеотиды один задругим с 3'-конца. В то же время в присутствии субстратов ее полимеразнаяактивность во много раз превосходит экзонуклеазную. Так, если в реакционнойсмеси присутствует хотя бы один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в " +А-системе"), деградация каждой копии,образовавшейся на первой стадии анализа, будет проходить вплоть до места положенияА (Т в матрице). В этом случае pdA включается много быстрее, чем удаляется, и,таким образом, накапливаются фрагменты, содержащие на 3'-конце цепи А. Аналогичнопроводят копирование в присутствии только dGTP, dCTP или dTTP. Смеси параллельно подвергают электрофорезу,как и в предыдущем случае, и получают ауторадиограммы, из которых сразусчитывается последовательность 5'/>3'-направление,считывается также снизу вверх). Из сравнения фореграмм «плюс-» и«минус-систем» делается однозначный вывод о нуклеотиднойпоследовательности в копиях и, следовательно, в матричном полинуклеотиде.
В настоящее время выделение фрагментов ДНК, создание рекомбинантныхгенов, а так же прямое секвенирование ДНК и кДНК становятся общедоступнымиметодами благодаря широкому внедрению ПЦР (полимеразной цепнойреакции).Сущность ПЦР заключается в использовании двух олигонуклеотидов-праймеров, способных специфически гибридизоваться споследовательностями нуклеотидов на противоположных концах двух цепей участкаДНК, в качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей спротивоположных концов матрицы с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В ходеповторяющихся циклов (температурной денатурации ДНК, отжига и энзиматическойдостройки праймеров) экспоненциально увеличивается количество дискретногофрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответсвующихпервичной структуре праймеров.
Применимость метода Сэнгера зависит от возможности получения одноцепочечныхкопий клонированных ДНК. Для этой цели можно использовать векторы на основебактериофага М13. Двухцепочечную чужеродную ДНК можно клонировать в двухцепочечнойрепликативной форме (РФ) фаговой ДНК, при этом после трансформации в белковуюоболочку будет упаковываться только одна из цепей ДНК. Во всех векторах типаМ13тр используются сходные полилинкерные последовательности, поэтому для инициацииполимеразных реакций пригоден один и тот же универсальный праймер. При амплификациисмеси генов (например, семейства генов) необходимо провести клонированиеПЦР-продуктов в векторах типа М13, в результате каждый фаг будет содержатьтолько одну вставку. При прямом секвенировании смеси генов наблюдаетсянесколько одинаково расположенных полос в разных дорожках геля. Приамплификации же одного гена можно проводить прямое секвенирование, не прибегаяк промежуточному субклонированию.
Выбор оптимального праймера для ПЦР зависит от 5 '- и 3 '-концевыхпоследовательностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Кроме того, для встраиванияПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в 5'-конец праймеров должны бытьвключены подходящие рестрикционные сайты. В этом случае ПЦР-амплификация споследующей рестрикцией продукта позволит провести его встраивание в ДНК М13,рестрицированную тем же ферментом. В разные концы амплифицируемого фрагменталучше включать сайты для разных рестриктаз, поскольку это позволит избежатьотжига векторной ДНК самой на себя и обеспечит положение клонированной вставкив определенной ориентации (так называемое направленное клонирование). Приподборе праймеров необходимо учитывать следующие факторы.
а. Следует убедиться в том, что амплифицируемое семейство генов несодержит консервативного внутреннего рестрикционного сайта, идентичного сайту,включенному в праймер.
б. После включения рестрикционного сайта 5' — конец праймера нужноудлинить, в противном случае рестриктаза не будет расщеплять праймер.Необходимая для каждого фермента длина выступающего участка и время рестрикцииуказаны в каталоге фирмы New England BioLabs.
Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необходимоперевести в одноцепочечную форму. Для этого ее вводят путем трансформации вкомпетентные клетки E. сoli. Бляшки, содержащие одноцепочечные рекомбинантные фаги, необходимо выколоть,нарастить в бактериальной культуре и депротеинизировать.
Затем переносят культуру в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и центрифугируютв микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 минут.Переносят 1 мл супернатанта (содержащего чистый фаг) во вторую пробирку на 1,5мл, добавляют 200 мкл полиэтиленгликоля и инкубируют при комнатной температурекак минимум 15 минут. Собирают фаг центрифугированием в течении 5 минут при 12000 g и отбирают супернатант. Быстро повторяютцентрифугирование и полностью удаляют все следы супернатанта. Затем осаждаютДНК ацетатом натрия, промывают ее 70%-ным этанолом и высушивают под вакуумом.Растворяют ДНК в 30 мкл воды. Полученная ДНК представляет собой одноцепочечнуюматрицу для секвенирования.
Ниже приведена конкретная методика секвенирования:
Материалы
• 5 х реакционный буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl
• Буфер для разведения фермента: 10 мМ трис-HCl, рН7,5, 5 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА
• 5 х смесь длямечения: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP
• Смесь для ddG-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP,dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl
• Смесь для ddA-терминации:по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP,50 мМ NaCl
• Смесь для ddC-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP,dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl
• Смесь для ddT-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP,dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl
• Стоп-раствор: 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05%бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол
• Универсальный праймер для секвенирования — 40 (0,5пмоль/ мкл)
• [35S]dATP/>S (1 мКи/37МБк в 100 мкл) (Amersham, UK;в состав набора не входит)
• 0,1 М ДТТ
МетодикаВсе реактивы добавляют с помощью диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), соединенного садаптером и шприцом 1710 с газовым затвором. Смесь для мечения предварительноразбавляют в пять раз.
1. Для каждойсеквенируемой матрицы смешивают в микроцен-трифужной пробирке на 1,5 мл дляполучения праймерной смеси 6 мкл воды, 1 мкл универсального праймера и 2 мклреакционного буфера.
2. Размечают микроплашкуFalcon 3911. В верхней ее части наносят номера клонов,а слева, сверху вниз, — буквы TCGA.
3. На дно каждой ячейки наносят 2 мкл праймернойсмеси, на боковые стенки — по 2 мкл раствора секвенируемой матрицы и центрифугируютплашку. Накрывают ее пленкой Saran® и крышкой и помещаютв водяную баню с температурой 70°С на 5 мин. Охлаждают плашку на столе (за этовремя происходит отжиг праймера и ДНК М13).
4. Пока плашка охлаждается, готовят смесь длямечения. Для этого в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,5 мкл 35S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл разведеннойсмеси для мечения и 3,5 мкл воды.
5. Размечают поликарбонатную микроплашку Techne 96® так же, как первую плашку, и в ячейки в ряду«Т» вносят по 2 мкл смеси для ddT-терминации. Аналогичным образомвносят смесь для терминации в ячейки остальных рядов и помещают плашку в термостатдля микроплашек с температурой 42°С.
6. После охлаждения плашки (п. 3) в течение 30 миндобавляют к смеси для мечения (для каждой матрицы) последовательно 1,77 мклбуфера для разведения фермента и 0,22 мкл фермента Sequenase®II. (Это позволяет держать фермент Sequenase® II внехолодильника минимальное время.)
7. По 2 мкл этой смеси наносят на боковую стенкуячеек, содержащих праймерную смесь, и центрифугируют плашку для перемешиваниякомпонентов. Включают секундомер.
8. Через 2 мин начинают переносить раствор из ячеекпервой плашки в соответствующие ячейки предварительно нагретой и помещенной втермостат поликарбонатной плашки. Для этого используют обычную микропипетку,быстро меняя наконечники после каждой ячейки (помните, что использованные наконечникирадиоактивны).
9. После того как перенесен раствор из последнейячейки, включают секундомер и в наконечник на шприце Hamiltonнабирают стоп-раствор.
10. Через 5 мин наносят по 5 мкл стоп-раствора на боковую стенку каждойячейки и центрифугируют плашку. После центрифугирования плашку, закрытуюкрышкой, можно хранить в морозильнике до использования (при — 20°С 35S-продукты можно хранить в течение недели).
Амплифицированные последовательности нуклеотидов можно увидеть в УФ-светепосле фракционирования продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза вприсутствиибромистого этидия. В большинстве случаев после ПЦР при наличии 1 — 10 нг ДНК-матрицывыявляется только одна полоса ДНК ожидаемой электрофоретической подвижности.Чувствительность и специфичность детекции продуктов амплификации значительнойувеличиваются при использовании различных вариантов ДНК—ДНК-гибридизации солигонуклеотидами-зондами, имеющими радиоактивную биотиновую, флюоресцентнуюили хемолюминесцентную метку. Это сделало возможным проведение работ сминимально возможным количеством материала, (например, с одной клеткой, однойкопией гена) без предварительной его очистки.
В качестве исходной матрицы для ПЦР может быть использована ДНК (иликДНК, полученная с помощью предварительной обратной транскрипции РНК), выделеннаякак из свежеполученных клеток и тканей, так и из замороженных, высушенных илификсированных препаратов, имеющих частично деградированные нуклеиновыекислоты, т. е. объекты, ранее недоступные для анализа. Так, с помощью методовПЦР была амплифицирована, клонирована и секвенирована ДНК египетской мумии,продемонстрирована возможность анализа специфических участков ДНК при наличииодного волоса, клетки, сперматозоида в целях идентификации личности и полахозяина.
Серповидно-клеточная анемия, />-талассемия,диабет, ревматоидный артрит, мышечная дистрофия, фенилкетонурия, гемофилия,дефицит />-антитрипсина — вот далеконе полный список генетических заболеваний, которые могут быть выявлены наранних стадиях развития эмбриона с помощью ПЦР Разработаны также подходы краннему выявлению и прогнозированию онкологических заболеваний.
3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ ВИРУСОВ.
Филогенетический анализ молекулярных данных является одним из подходов ктеоретическому изучению структуры и функции генетических макромолекул (РНК,ДНК, белков) и их эволюционного преобразования. Основная цель филогенетическогоанализа — изучение эволюционного порядка дивергенции последовательностей генови белков или их частей, а также восстановление списков эволюционных событий(замен нуклеотидов, делеций и вставок) в предковых линиях этих макромолекул.
Основным инструментом филогенетического анализа является сравнениеблизких по структуре или по функции генов или белков, и прежде всего, сравнение их первичных последовательностей.
Важнейшим свойством функционально значимых структур макромолекул являетсяих эволюционный консерватизм. Чем меньше функциональная важность отдельных участковгенов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной изменчивости. Так, например,псевдогены по-видимому полностью утратили функциональную активность. Для ниххарактерно быстрое накопление в ходе эволюции различных замен, делеций и вставок,разрушающих исходную структуру гена. С другой стороны, гистоны Н4, играющиеважную роль в упаковке хроматина, почти не изменялись на протяжении всейэволюции животных.
Консервативность генов позволяет выявить отдаленное родство между ихпредставителями, давно разошедшимися в ходе эволюции и выполняющими иногдаразные функции. Однако для филогенетического анализа необходимо и наличиеопределенного уровня изменчивости генов. Мутации, делеции и вставки являютсясвоего рода метками, благодаря которым удается восстановить пути эволюциисовременных форм макромолекул. Гены с разной величиной консервативностипригодны для изучения разных эволюционных уровней. Сильно консервативные гены иих продукты (гистоны, тРНК) нельзя, например, использовать для исследованияэволюции отрядов и более мелких таксонов, но с успехом можно применять дляизучения эволюции более крупных таксонов. Сильно вариабельные гены, наоборот,дают хорошее разрешение лишь на поздних эволюционных этапах.
В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) споследующим анализом нуклеотидной последовательности широко используется дляточной идентификации вирусов и определения их родства в отношении другихштаммов. Для сравнительной характеристики геномов различных штаммов вирусовтакже проводят рестрикционный анализ ПЦР-продуктов. Обычно для построения филогенетическогодерева используются данные последовательностей нуклеиновых кислот.Филогенетическое дерево очень ясно показывает родство между вирусами, еслианализируется большое количество изолятов. Для этих целей существует многокомпьютерных программ. Наиболее популярные пакеты программ-PHYLIP(PHYLogeny Inference Package), PAUP(Phylogentic Analysis Using Parsimong),CLUSTALи MEGA.
Для филогенетического анализаособенно интересны РНК-содержащие вирусы, которые существуют как гетерогенныепопуляции. Их геном более генетически пластичен, чем геном ДНК-содержащихвирусов.
Так, геном вируса бешенства, который относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae,представлен одноцепочечной негативной РНК длиной около 12000 пар оснований(п.о), кодирующей пять основных белков.
Белки подразделяются на три функциональные группы:оболочечные (G ,M) нуклеокапсидный(N) и РНК-полимеразный комплекс, состоящий из L и NS белков. Белки N,NS и Lвместе с вирионной РНК образуют нуклеокапсид, который окружен мембраной,содержащей трансмембранный гликопротеин G,ответственный за антигенные свойства вируса. Существование псевдогена y между G и L цистронами, является отличительной особенностью вирусабешенства от вируса везикулярного стоматита.
N-ген лиссавирусов, как показалоклонирование и секвенирование, является наиболее консервативным по своейструктуре из всех генов вируса бешенства.
Mannen K.et al, в 1991 г. определили большую зависимость различий в N-гене от географической локализации, чем от хозяйскойспецифичности. В Онтарио вирус бешенства, который описан как единственный«Арктический» тип, разделили на четыре основных типа. Эти типы филогенетическиразветвляются на две основные ветви, одна из которых состовляет один тип,вторая три основных типа, что отражает историческое передвижение вируса врегионе от середины к концу 50-х гг. Эпизоотия передвигалась на юг Онтарио ссевера и Квебека. Изменения в последовательности N-гена, определенных для 4-х вирусных типов, могут представлять генетический маркердля более существенных изменений в других частях вирусного генома.
Kissi et alпредставили первое сравнение между генотипами и молекулярными различиями N-гена внутри первого генотипа. Филогенетический анализ генануклеопротеина 82-х лиссавирусов подтвердил существование шести генотипов лиссавирусов,и также выделил изоляты бешенства первого генотипа в отдельные генетическиелинии. Изоляты с меньшей чем 80% нуклеотидной и 92% аминокислотной гомологиейотносятся к различным генотипам. Два коротких региона из 400 нуклеотидов,кодирующих аминоконец N-протеина, и 93 нуклеотида,кодирующих N-NS-регион, могутбыть использованы для определения географического распределения основныхвирусных линий. Выявлено два региона, имеющих наименьший уровень гомологии:участок длиной 199 пар оснований (нуклеотиды от 1080-го до 1278-го) и болеепротяженный фрагмент, расположенный между 99-м и 405-м нуклеотидами.Филогенетическое дерево построили, используя пакет программ MEGA.С их помощью получили дерево с ветвями, делящимися на 6 кластеров, которыесоответствуют 6-ти генотипам. Сравнение изолятов показало, что в генетическомплане наиболее близкими оказались 4-й и 5-й генотипы, у которых уровеньразличий составил 79,8% (нуклеотидный уровень) и 93,3% (аминокислотный уровень)[Duvenhage virus(4) и EBL1(5)]. Внутри генотипа 1 наименьшее сходствосреди изолятов из Азии и Латинской Америки – 83,3%; и наибольшее сходство в изолятахиз Африки и Латинской Америки – 92,2%.
Филогенетический анализ изолятов 1-го генотипа вируса бешенства.
Kissi et al.идентифицировали 11 филогенетических линий, взятых в соответствии с их географическимпроисхождением и видом хозяина: Африка 1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азия,Арктика, Европа/Средний Восток, Латинская Америка 1 и 2 и две группы вакцинныхштаммов. Филогенетическое дерево строилось на основании сравнения фрагмента илицелого N-гена.
Этот анализ позволил более точно определить циркуляцию позонам и установить происхождение и распространение бешенства для некоторыхлиний, которые, возможно, произошли независимо на этом континенте от различныхпредшественников. Хотя циркуляция африканских вирусов 1а и 1в более отлично отвирусов, распространенных в Европе и Среднем Востоке, однако была выявленагенетическая связь между ними, что свидетельствует об общем предке.
Выяснено, что накопление большинства нейтральных мутаций вгеографически разделенных вирусных популяциях привело к значительнымрасхождениям в нуклеотидной последовательности гена нуклеопротеина.
При исследовании гена нуклеопротеина 11-ти вирусов бешенстваяпонскими учеными было выявлено 9 отдельных кластеров по гомологии менее 90%региона N-гена. Тем самым они подтвердили данныефилогенетического анализа, полученные Kissi et al.
Таким образом, варианты вируса бешенства, сгруппированные всоответствии с их географическим распределением, могут быть использованы дляисследования эволюционного развития вируса бешенства.
Принципы и методы ОТ-ПЦР.
Обратно-транскриптазная ПЦР состоит из двух этапов:
1- синтез комплементарной ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы изатравки
2- амплификация гена или его фрагментов при помощи фермента термостабильнойДНК-полимеразы и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров),комплементарных 3'- концевым последовательностям антипаралельных цепей ДНКгена. Повторяя стадии денатурации, отжига праймеров и полимеризации (достройкапраймеров) 30-35 раз за 2-3 часа получают миллионы копий специфического участкагенома вирусов и бактерий.
Анализ ПЦР-продуктов.
АликвотыПЦР-продуктов разрезают соответствующими ферментами и разделяют в 1%-магарозном геле. Учет результатов проводят по размеру ПЦР-продуктов с помощьюэлектрофореза в агарозном геле. На основании размеров и расстояний пробеговмаркерных ДНК вычисляют размеры исследуемых фрагментов ДНК.
4. КОМПЬЮТЕРНЫЙАНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕКСТОВ.
Выявление и анализ закодированных в последовательностях функциональных сигналов требует применения современных методов информатики — качественных базданных с современными средствами управления, новейших методов распознаванияобразов, статистических исследований, применения специальных алгоритмов дляпреодоления возникающих вычислительных трудностей.
В настоящее время исследованиефункциональных свойств расшифрованных последовательностей нуклеиновых кислот — это новый раздел молекулярной биологии, граничащий с информатикой, с однойстороны, и молекулярной биофизикой — с другой. Можно с уверенностью сказать,что в настоящее время анализ последовательности биополимера позволяет извлечь лишь очень небольшую долю закодированной в ней информации. В конечномсчете точное выявление функциональных особенностей в последовательностяхнуклеиновых кислот будет возможно только после детального исследованиясоответствующих реакций, осуществляемых нуклеиновобелковыми комплексами.
Для оперативной работы с последовательностями создаются специальныебанки данных. В банке в доступном для пользователя виде хранится каждая расшифрованнаяпоследовательность и ее паспорт, в котором указаны различные сведения о ней.Это сведения об организме, из которого выделена последовательность, одокументе, где она описана, о расположении на ней регуляторных участков ибелках, которые она кодирует и т.д. В настоящее время созданы три большие базыданных последовательностей нуклеиновых кислот: «Genbank»(Лос-Аламос, США — более 30 млн. нуклеотидов), база данных нуклеотидных последовательностей Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL, Гейдельберг, ФРГ — более 30 млн. нуклеотидов) и «Генэкспресс» (СССР,ВИНИТИ-ИМГ АН СССР — более 11 млн. нуклеотидов). Известны также несколько белковых баз данных, наиболее представительной из которой является MBRF-PIR (США). Эти базы данных распространяются на различных носителях — магнитных лентах и дисках, на оптических дисках.
Кроме построения филогенетических древ геномов вирусов компьютерныйанализ применяется при поиске гомологий, распознавании кодирующих областей,функциональных сигналов, физическом (рестрикционном) картировании молекул ДНК идля предсказания вторичных структур РНК.
Сейчас в мире создано большое количество программ (обычно организованных в пакеты ), предназначенных для анализапоследовательностей нуклеиновых кислот и избавляющих исследователей от многихтрудоёмких рутинных операций, в том числе: подсчёт числа моно -, ди – итринуклеотидов, перевод нуклеотидной последовательности в аминокислотную и т.д.
Все программы условно делятся на два класса: общегоназначения и специального. Первые осуществляют ряд_ наиболее распространенныхопераций по сбору и анализу последовательностей и позволяют: вводить иредактировать новые последовательности, считывать с помощью сканирующихустройств информацию непосредственно с автографов или гелей', находить участкиузнавания эндонуклеаз рестрикции и представлять результаты в удобном(табличном или графическом) виде, находить участки с элементами поворотной изеркальной симметрии (палиндромы), транслировать нуклеотидную последовательностьв белковую во всех трех рамках считывания, сравнивать две последовательностиметодом точечных матриц гомологии, сравнивать новую последовательность со всемиданными Ген Банка, находить участки, обогащенные теми или иными нуклеотидами,вычислять гипотетическую температуру плавления ДНК, осуществлять автоматическуюсборку секвенированных фрагментов в единую структуру — молекулу ДНК,транслировать белковую последовательность в нуклеотидную с учетомнеравномерности использования кодонов-синонимов, определять молекулярную массуНК и белков, предсказывать вторичную структуру белков, вычислять свободнуюэнергию образования шпилек и др.
Программы специального назначения создаются для решения более специальныхи часто более сложных задач и представляют интерес для более узкого кругаспециалистов. Так, например, они могут выполнять ряд функций: вычисление длиныфрагментов ДНК на основании их электрофоретической подвижности в гелях; выборгибридизационных зондов; предсказание вторичной структуры РНК; локализациянуклеотидов в гене, которые могут быть изменены (без изменения аминокислотнойпоследовательности) с целью введения сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции;нахождение участков с потенциально возможной структурой Z-формы ДНК; выявлениефункционально значимых участков в неизвестной вновь расшифрованной структурена основании ранее выведенного консенсуса (в результате сравнительного анализаряда известных структур с одинаковой функцией); локализацию участков,кодирующих белки, и т.д.
Для примера представлено меню пакета программ MICROGENIE,из которых следует, какие функции общего или специального назначения можетвыбрать исследователь при работе с нуклеотидными последовательностями.
Программа общего назначения «COMMON»обеспечивает ввод последовательности в ЭВМ, а также проверку введенных данных вдиалоговом режиме. Они позволяют также редактировать нуклеотидные последовательности:вводить замены и вставки, исключать нуклеотиды, вырезать, встраивать иобъединять нуклеотидные последовательности и таким образом моделироватьгибридные и мутантные молекулы ДНК. Ввод последовательностей в память машиныможно осуществлять вручную с клавиатуры, но в последнее время созданы приборыдля автоматического сканирования авторадиограмм и секвениру-ющих гелей, полученныхпри использовании флуоресцентных меток, передачи данных сразу в компьютер ипоследующего анализа последовательности с помощью специальных программ. В недавновышедшей в издательстве IRL (Оксфорд) книге«Анализ сиквенса нуклеотидных кислот и белков» подробно описываютсякак конструкция сканирующих устройств, так и программы для чтения авторадиограмм.Созданы программы для восстановления первичных структур высокомолекулярных ДНКна базе данных сиквенса фрагментов, полученных при ее Неспецифическомрасщеплении (например, ультразвуком,). Родство между любой парой фрагментовДНК выявляется на основании совпадения последовательности нуклеотидов в ихструктурах, причем эти совпадающие последовательности и являются местомперекрывания и такие два фрагмента могут быть объединены в более протяженнуюструктуру. Процесс отбора фрагментов и стыковки продолжается до. тех пор, покане будет восстановлена вся первичная структура исследуемой ДНК. Одной из такогорода программ является «CONTIG» (существуетее вариант для компьютера IBM PC), созданная в лаборатории Ф.Сангера (Кембридж, Англия).Ниже приводятся основные операции, которые позволяет осуществлять программа«CONTIG»:
1) хранение сиквенса каждого фрагмента;
2) отбор смежных фрагментов и сборка последовательностей из них;
3) сравнение данных, полученных при чтении новых авторадиограмм, с ужеустановленными последовательностями;
4) объединение двух фрагментов с помощью третьего, представляющего собойобласть перекрывания первых;
5) поиск участков ДНК, комплементарных уже установленным, что является проверкойправильности сборки полной структуры ДНК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
МетодМаксама-Гилберта и метод Сэнгера основаны на одном принципе. В первом используетсяспецифическое расщепление ДНК, обусловленное природой оснований, во втором - статистический синтез ДНК, заканчивающийся на каком-либо одном из 4 нуклеотидов.Таким образом, основой обоих методов является получение полного (статистического)набора фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырёх нуклеотидов.
Химическийметод (метод Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исследуемаяДНК не слишком велика (200-500 звеньев). В том случае, если речь идет осеквенировании высокомолекулярной ДНК, лучше применять метод полимеразногокопирования (метод Сэнгера), чтобы не вводить процедуру рестриктазногорасщепления с выделением индивидуальных фрагментов. При энзиматическом секвенированиипротяженных одноцепочечных ДНК (например, бактериофагов) можно применять наборолигонуклеотидов-затравок, синтез которых в настоящее время не требует большихзатрат времени и труда. Для двутяжевых высокополимерных ДНК наиболее удобенметод слепого энзиматического секвенирования с применением универсальнойзатравки (их выпускают многие фирмы) и обработки данных с помощью ЭВМ. Химическийметод также может быть применен, но в этом случае необходимо вырезать из вектораисследуемые фрагменты ДНК, и это усложняет всю процедуру.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Жарких А.А. Методы филогенетического анализа генов и белков//Молек.биология. (Итоги науки и техники. ВИНИТИ; М. 1985)
2. Компьютерный анализ генетических текстов / А.А.Александров, Н.Н.Александров,М.Ю.Бородовский И ДР. М.: Наука.
3. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Отв. ред.Р.И.Салганник.-Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990.
4. Молекулярная клиническая диагностика.Методы: Пер. С англ. / Под ред.С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999.
5. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компанентов.– М.: Химия, 1978.
6. Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухин А.С. Химические основы геннойинженерии: Учебное пособие. – М.: Изд-во МГУ, 1994.
7. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Подред.М.А.Прокофьева. – М.: Изд-во МГУ, 1985.