Реферат: Клонирование

Термин «клон» происходит от греческого слова«klon», что означает — веточка, побег, черенок, и имеет отношение,прежде всего к вегетативному размножению. Клонирование растений черенками,почками или клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, известноуже более 4-х тыс. лет. При вегетативном размножении и при клонировании гены нераспределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются вполном составе в течение многих поколений.

Однако у животных есть препятствие. По мере роста ихклеток, они в ходе клеточной специализации – дифференцировки – теряют способность реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре

Впрочем, оказывается, есть ящерицы-прыгуны, которые испоконвеков размножаются именно клонированием, так как у них в роду есть толькосамки.

Хотя это не совсем клонирование, это называетсяпартогенез. Эта встречающаяся в природе (прежде всего у беспозвоночных) формаоднополого размножения предполагает развитие яйцеклеток без оплодотворения.Эксперименты по искусственному провоцированию партеногенеза начались еще вконце XIX века (работы русского зоолога Тихомирова). В дальнейшем ученые,применяя различные физико-химические раздражители, такие как растворы сильныхкислот, трение, нагрев, сумели получить партеногенез у многих животных, в томчисле млекопитающих

Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервыебыла показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Опыты с ними показали,что серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-тостепени увеличивает эту способность.

Уже в начале 90-х была решена и проблема клонирования эмбриональных клеток млекопитающих. Реконструированные яйцеклеткикрупных домашних животных, коров или овец сначала культивируют не in vitro, a invivo — в перевязанном яйцеводе овцы — промежуточного (первого) реципиента.Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго)реципиента — коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит дорождения детеныша.

Статья Уилмута с соавторами, появившаяся в начале 1997года, стала сенсационной именно потому, что впервые клональное животное (овцапо кличке Долли) появилось  в результате использования донорского ядраклетки молочной железы взрослой овцы. У этого первого успешного экспериментаесть существенный недостаток — очень низкий коэффициент выхода живых особей(0,36%). Однако он  доказывает возможность полноценного клонирования, (илиполучения копии взрослого человека). Остаётся лишь разрешить технические иэтические вопросы.

Самое интересное, что методология клонирования,использованная Уилмутом, была подготовлена в СССР ещё в 1987-ом году, но вАкадемии наук на это прореагировали вяло — не до того, видимо…

Первые опыты на амфибиях

Возможностьклонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов вопытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг разработалимикрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкойстеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Ониустановили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии егоразвития — бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развиваетсядальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша,донора ядра, продвинулось на следующую стадию — гаструлу, то лишь менее чем в20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результатыпозже были подтверждены и в других работах.

Большойвклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в опытах сюжноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора ядериспользовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клеткиэпителия кишечника плавающего головастика. Ядра яйцеклеток реципиентов он неудалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинствеслучаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая частьих них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы,2,5% — стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей (рис. 1).Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связанос тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольнодлительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли бытьиспользованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многиедругие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.

ПозжеГердон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство реконструированныхяйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадиигаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и сновапересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется«серийной пересадкой», в отличие от «первичной пересадки»).Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и ониразвивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными врезультате первичной пересадки ядер.

ЗатемГердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма впитательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных ииспользовать уже эти клетки в качестве доноров ядер. Примерно 25% первичнореконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийныхпересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом,было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X.laevis) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие, по крайней мере,до стадии головастика.

Всвою очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра неделящихсяи полностью дифференцированных клеток крови — эритроцитов лягушки Ranapipiens. После серийной пересадки таких ядер 10% реконструированных яйцеклетокдостигали стадии плавающего головастика. Однако даже с помощью многократныхсерийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклеткидальше стадии головастика не развивались.

Такимобразом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могутбыть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Некоторые авторы называютподобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее называть ихклонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путемне взрослых животных, а зародышей.

Дифференцировкаклеток в ходе развития позвоночных сопровождается инактивацией неработающихгенов. Поэтому клетки теряют тотипотентность, дифференцировка становитсянеобратимой. В конце концов у одних клеток происходит полное репрессированиегенома, у других — в той или иной степени деградирует ДНК, а в некоторыхслучаях разрушается даже ядро. Однако наряду с дифференцированными кочеткамикультивируемыеin vitro клеточные популяции содержатмалодифференцированные стволовые клетки, которые и могут быть использованы какдоноры ядер для клонирования млекопитающих.

Опытыс амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того жеорганизма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировкипостепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированныхяйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitroв какой-то степени увеличивает эту способность.

Неудачи экспериментов смышами

Успешныеопыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионовмлекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из своих работ отмечал, чтовсе необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно, почему мышь досих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами должны были статьименно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако предсказание

МакКиннеллане сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались ипротекали весьма драматично. К тому времени, замечу, весьма основательно былиизучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих, и, вчастности, мыши как модельного объекта.

Работаметодически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объемяйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однакоэти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научилисьмикрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток)мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако всеполученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадиибластоцисты.

/>В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том,что они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели только материнский,а две — отцовский геном. Это, якобы, зависело от того, какой пронуклеус былоставлен в яйце — женский или мужской, он и определял развитие особи по типугиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с тем,что, удаляя один пронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатываяяйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомозиготные(с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадиибластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.

Казалось,теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью повсем генам. Это особенно важно в селекции, так как для получениясельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого скота, сзакрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются десятки летработы.

Однако,к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многиепытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом диплоидныеандрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях,что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из неоплодотвореннойяйцеклетки) эмбрионы.

Значительноусовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку, МакГрат иСолтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живыхмышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы, но еслидонорами были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и прежде,развивались только до стадии бластоцисты.

МетодМакГрата и Солтера стал широко использоваться разными экспериментаторами. Так,Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активированных к партеногенезу,и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей. В этих случаях эмбрионыпогибали на ранних стадиях. Если же наоборот, пронуклеусы получали изоплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные илишенные ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения. Суранис соавторами установили, что если добавить женский пронуклеус из зиготы мыши кгаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то нормального развития не происходит,добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны,рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенныхяйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужскихили двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Этиопыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуются два наборахромосом — отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных видовмлекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не удалосьповторить.

Однакоэти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982 году онипересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы.Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобыбыли получены четыре взрослых самки. В свете вышесказанного эти результатывесьма маловероятны.

Гибельпартеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей умлекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского иотцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, былназван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, чтодля нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома.Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больший резонанс.

Авторысообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты вэнуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок исамца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров иудаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затемреконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадиибластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист триразвились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторыиспользовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий(7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто изработающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, идостоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрати Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточноймассы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированныхяйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты.Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность развиватьсятолько до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток,содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы илибластоцисты.

Этии многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядрарано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней активациейгенома зародыша — уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, вчастности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группыгенов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможнопоэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты надругих видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами,несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления ометодологии клонирования млекопитающих.

Кролики, коровы и свиньи

Американскиеисследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и Солтера, получили 6живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенныеядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовалфенотипу донора.

Однакотолько 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальныхживотных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющийрассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных.Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она показала возможностьклонирования эмбрионов кроликов.

Работас реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец,идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a invivo — в перевязанном яйцеводе овцы — промежуточного (первого) реципиента.Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго)реципиента — коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит дорождения детеныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки вагаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцеводовцы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются вяйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получилинеплохие результаты и при культивировании.

АмериканцыРобл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без прокалываниямембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготытак называемые кариопласты — мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающейих цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначалазиготы центрифугировали, чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранулжелтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительнооблегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянноймикропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей ипереносили его в энуклеированную зиготу.

Реконструированныезародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцеводовцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара иисследовали. Реконструктурированные зародыши в этой работе развивались только втех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышейдостигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второмуреципиенту — в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят.Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, тореконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позжебыли и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что ему удалосьполучить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результатепересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточногозародыша  (рис. 3). Автор утверждал, что большинство ядер сохраняеттотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированныхяйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки вматку коров — окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальшенормально развиваться.

Бондиолии соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров,трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированныхреципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетическиидентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядерклеток одного донорского эмбриона.

Такимобразом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долгосохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированныхяйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышейкрупного рогатого скота практически решены. Но остается основная задача — найтидонорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослыхживотных.

Клонированиюэмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа. Скудность данных,видимо, и связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

Клонирование овец

Уиладсинеще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развитияядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядрабластомеров 16-клеточных зародышей, развивались нормально до стадии бластоцистыв перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения отагара и пересадки в матку овцы — второго реципиента — еще 60 дней. В другомслучае донорами служили ядра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живыхягненка, фенотип которых соответствовал породе овец — доноров.

В1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона иранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первомслучае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породеовец — доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненокпогиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе — донору. Авторысчитали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивациянекоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты ужене могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальноеразвитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестведоноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые invitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее,в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клоновец — 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональныхклеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделялимикрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона(бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей(по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культурустволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-хпассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными сэпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначенакак TNT4.

Чтобыдонорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадияхклеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 наопределенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированныеяйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионызаключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 днейэмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом.Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их вматку овцы — окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения.Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячноговозраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которойполучали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Этаработа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, — значительноедостижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумногоинтереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клеткимолочной железы овцы было получено клональное животное — овца по кличке Долли.Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще ифибробластоподобные клетки (фибробласты — клетки соединительной ткани) плода иклетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали отшестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместребеременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом — 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноровядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода — на4-6-м пассажах и клетки молочной железы — на 3-6-м пассажах. Деление клетоквсех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали вэнуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинствореконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводеовцы, но некоторые и in vitroв химически определенной среде.Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro водной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.(Поэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можнообойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этомнужны дополнительные данные.)

Выходморул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы былпримерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядериспользовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живыхягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морулили бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочнойжелезы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живойягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов(0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех серияхэкспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорамиядер для одного, фибробласты плода — для двух и эмбриональные клетки — четырехягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, доноромядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсети фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента(рис. 4). Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успехавторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных клеточныхкультур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобранымалодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованыкак доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитываярезультаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного циклаяйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Новернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов обойтиэтические проблемы – выращивать отдельные органы из клеток реципиента илииспользовать животных. Но это только «косметический»метод. Реальный шаг к бессмертию — искусственное изменение ДНК. В июне2000 года  и случилось то, чего так долго ждали и чего некоторые такбоялись. Появилось сообщение, что ученым из уже знаменитой своей овцой Доллишотландской фирмы PPL Therapeutics (коммерческого отделенияРозлин Института в Эдинбурге) удалось получить успешные клоны овечек сизмененной ДНК.  Шотландские ученые смогли осуществить клонирование, прикотором генетический материал клона был «подправлен» с лучшуюсторону. Однако именно этого, генетического вмешательства и боятся многие противникиклонирования.

Хотясуществует и уже  узаконенный путь обхода запрета наклонирование человека, который называется «терапевтическое»клонирование человеческих существ. Речь идет о создании ранних эмбрионов — своего рода банка донорских тканей для конкретных индивидуумов. Именноиспользуя его, американская компания Advanced Cell Technology Inc. (ACT, городВустер, штат Массачусетс) объявила в ноябре 2001 года об успешном клонированиичеловеческого эмбриона.

Интересноотметить, что эта компания в октябре получила правительственный грант  1.8млн. $ на проведение исследований в области биотехнологии. Порадовала и реакция конкурентов: «Я очень рада, что мы не одиноки. Мы получаемэмбрионы каждый день», — заявила директор Clonaid Бриджит Боселье (BrigitteBoisselier).

Дляэксперимента учёные использовали в общей сложности 17 женских яйцеклеток:удалив из них ядра, они внедрили на их место ядра, позаимствованные из клетоккожи взрослого человека. В трёх яйцеклетках начался нормальный процесс роста иделения. Когда эмбрионы состояли из 6-ти клеток каждый, учёные прервали ихдальнейшее развитие с тем, чтобы использовать полученные клетки для дальнейшихисследований.

Следуетотметить, что стволовые клетки, которые, собственно, и являются предметоминтереса ученых, занимающихся исследованиями в области терапевтическогоклонирования, можно выделить только из эмбриона, в своем развитии достигшегостадии бластоцисты (около сотни клеток). Однако специалисты ACT заявляют, чтосозданные ими, в другом эксперименте,  обезьяньи зародыши развились достадии бластоцисты. Из эмбрионов были выделены стволовые клетки, которые в ходеих специализации удалось превратить в нейроны. Сообщается, что эти нейроныоказались в состоянии вырабатывать допамин и серотонин — два важнейших гормона,которые вырабатываются мозгом.

В интервью CNNпрезидент компании ACT доктор Майкл Вест сказал, что его компания незаинтересована в клонировании людей, и что она не создавала эмбрион человекадля репродуктивных целей «Мы только хотим помочь больным людям,нуждающимся в помощи, и в этом состоит работа всего нашего центра».

Определениелечебного клонирования человека

Одобрениеи разрешение терапевтического клонирования человека основывалось наморально-этическом различии между «репродуктивным» и «терапевтическим»клонированием. Репродуктивное клонирование — это воспроизведение всегочеловеческого организма целиком. Лечебное же (медицинское, терапевтическое)клонирование по определению прекращает копирование человеческих клонов наэмбриональной стадии и не допускает имплантации и нормальной беременности. Притерапевтическом клонировании эмбрион разрушают на ранней стадии развития — настадии бластоцита, и получают из него культуру стволовых клеток. Для полученияэтой клеточной массы, которая при нормальной беременности дает начало плоду,эмбрион неизбежно следует разрушить. Стволовые клетки человеческого эмбрионаназывают плюрипотентными стволовыми клетками (ПСК), поскольку они могут даватьначало разнообразным типам клеток. В ноябре 1998 года доктор Томсон (Thomson) вВисконсинском университете получил культуру стволовых клеток человеческогоэмбриона из зародышей, предоставленных клиниками по искусственномуоплодотворению в пробирке — in vitro. Эти клетки были плюрипотентны, то естьобладали большими возможностями, и неограниченно делились в лабораторныхусловиях. При имплантации под кожу мыши они давали начало клеткам выстилкикишечника, хряща, кости, мышц и эпителия нервной системы.

Открытиеспособности стволовых клеток эмбриона давать начало другим типам клетокпородило веру в их целебные свойства, с помощью которых можно победить едва лине любую болезнь и избежать старения. Было высказано мнение, что наивысшийтерапевтический потенциал эмбриональных стволовых клеток в обновлении тканейможет быть реализован при их выделении из собственных клеток пациента. Чтобыполучить «по заказу» такие индивидуально специфичные ПСК, требуетсяприменить метод переноса ядра соматической клетки (ПЯСК) — этот же метод былиспользован при клонировании овцы Долли для создания эмбриона, идеальноподходящего пациенту. Цель эмбрионального, или терапевтического, клонированиясостоит в получении стволовых клеток человеческого эмбриона, идентичныхсобственным клеткам пациента, что со временем можно будет использовать для леченияболезней. Пока же о стволовых клетках эмбриона известно лишь то, что из нихможно получать клетки разных типов, которые способны длительное времясуществовать в лабораторной культуре. Способности же управлять дифференцировкойи пролиферацией пока остаются на уровне гипотез.
Эмбрион– нечто большее, чем человеческая ткань?
Двекрайние точки зрения на ограниченное клонирование отражают двеморально-этические позиции по отношению к эмбриону человека. Эмбриолог Уинстон(Winston) утверждает: «Никто не собирается, да и не может клонироватьчеловеческие эмбрионы… Всё, что нам нужно, — получить ткань эмбриональногопроисхождения и выделить из нее участки клеток, с помощью которых можно будетлечить больных людей». Однако профессор Скэрисбрик (Jack Scarisbrick) говоритиное: «Это — клонирование. Вы создаете точную копию человека. И от этогонового человека отрываете кусок, а потом убиваете его». Почему двоевысокообразованных ученых высказывают прямо противоположные мнения об одной итой же методике? Первое мнение отражает биологический подход. Согласно ему,эмбрион, который не прошел имплантацию и внутриутробное развитие, не имеетникаких интересов, которые общество должно защищать. Такой эмбрион — не болеечем скопище клеток, управляемых не мозгом, а генетическим кодом.Противоположный подход рассматривает эмбрион как живого человека, которогоследует воспринимать как полноценную личность с первого мгновения егосуществования. «Вопрос не в том, похож ли развивающийся человеческийзародыш на взрослого человека, а в том, соответствует ли его развитиечеловеческой природе на данной конкретной стадии» (5). Общество обязанозащищать человеческий эмбрион в силу его генетической уникальности испособности вырасти в личность. Вот почему эксперименты над эмбрионами — ничемне оправданное убийство.

В 1994 годуНациональный институт здоровья США учредил комиссию по вопросу о человеческомэмбрионе с целью примирения этих двух противоположных точек зрения. Былразработан компромиссный подход, согласно которому эмбрион — не личность, но,будучи формой человеческой жизни, обладает моральной ценностью. Критерий этогопромежуточного статуса — определение человеческой жизни и личности черезобладание тремя обусловленными деятельностью мозга способностями: сознанием,способностью мыслить и способностью ощущать. Был сделан вывод, что человеческаяличность проявляется только на 14-й день развития. В основу этого вывода леглитри биологических факта. Во-первых, первичная полоска — предшественникцентральной нервной системы развивается на 14-й день (6). Во-вторых, на раннихстадиях развития эмбриона его индивидуальность размыта. До седьмого-десятогодня развития возможны два явления: формирование близнецов и мозаицизм.Формирование близнецов — способность эмбриона разделяться и образовыватьнесколько генетически идентичных особей. В случае мозаицизма два разныхзародыша сливаются воедино, образуя один организм с двумя различными геномами.И, наконец, приблизительно на 14-й день (иногда раньше, на 7-й -10-й день)происходит имплантация в стенку матки; до 60% эмбрионов при естественномоплодотворении не имплантируются в теле матери. Вывод: если в природебольшинство зародышей в возрасте менее 14 дней погибают естественным путём, тоэксперименты над эмбрионами допустимы до достижения 14 дней без имплантации.

Устойчивость компромиссной точкизрения.

Многихубеждает утверждение, что жизнь человека обретает уникальную, только ейприсущую ценность лишь тогда, когда человек становится личностью. Есть ещё однасходная точка зрения, рассматривающая человеческий эмбрион с позиций роста иразвития: моральная ценность внутриутробной жизни возрастает с течениембеременности, и на поздних её стадиях (или к моменту рождения) достигаетобщечеловеческого уровня. Однако принципиально важно рассмотреть предпосылки,на которых основаны «моральная граница» 14-го дня беременности изапрет на имплантацию эмбриона. Первая предпосылка: личностность должнаопределяться нашим восприятием человека как такового. Вторая предпосылка:составляющие личности — сознание, способность мыслить и способность ощущать.Третья предпосылка: первичная полоска есть точная мера сознания, способностимыслить и способности ощущать.

Очевидно,что, в соответствии с биологическими данными, сознание, способность мыслить испособность ощущать развиваются на более поздних стадиях. В недавней статье в«Журнале Американской медицинской ассоциации» (JAMA) Ланца (Lanza) идр. доказывают, что это — чёткая и реальная граница, поскольку как толькоформируется первичная ось тела, обретает конкретность «индивидуальность»,являющаяся ключевым понятием для определения личности. Другие же учёныепризнают, что граница 14-го дня выбрана произвольно, поскольку«биологически» ясно, что раньше этого времени жизнь существовать неможет. Специалист по этике из Принстонского университета Питер Сингер (PeterSinger) предполагает, что «новорожденный ребёнок не способен ни ксамосознанию, ни к осознанию собственного существования во времени — онприобретает эти качества много позже. Это — не личность. Его жизнь заслуживает защитыне более, чем жизнь плода». «В нашей книге „Должен ли ребенокжить?“ моя коллега Хельга Кузе (Helga Kuhse) и я высказываемпредположение: только в возрасте 28 дней о новорожденном можно сказать, что онимеет такое же право на жизнь, как любой человек. И, конечно же, лишь намногопозже ребенок приобретает чувство собственного существования во времени…».Если довести ход мысли сторонников «личностного подхода» дологического завершения, выходит, что инвалиды, умственно отсталые люди,маленькие дети и старики — неполноценные члены общества.

«Имплантационныйподход», на первый взгляд, кажется обоснованным. В определенных ситуацияхпрерывание беременности — в интересах общества; ведь страшно подумать, чтоможно дать жизнь эмбрионам, возникшим в ходе экспериментов, мутантным иклонированным. Нельзя допустить, чтобы такие дети появлялись на свет. Вообще,клонирование человека недопустимо, потому что оно нарушает принцип уникальностикаждой человеческой личности. Клонирование обесценивает уникальность личности — весьма вероятно, что клонированный человек будет считаться неполноправным поотношению к человеку, появившемуся на свет обычным образом. В отношенииисследований плодов в матке уже разработаны этические нормы, допускающиевмешательство в тех случаях, когда ожидаемая польза перевешивает риск жизниличности плода. Следовательно, согласно этому подходу, эксперименты надэмбрионами или клонирование допустимо производить только в лабораторныхусловиях, и результатом этих операций может быть лишь производство клеточноймассы, а не тканей и органов.

Но чемотличаются эмбрион в утробе и эмбрион в чашке Петри? Есть мнение, что«разница между эмбрионом в утробе и гаметами в чашке Петри состоит в том,что эмбриону для развития достаточно „естественного“ существования…Лабораторный же эксперимент требует активного, направленного и»искусственного" (в виде механического переноса в матку)вмешательства третьей стороны, без которого беременность невозможна".Иначе говоря, перенесение эмбрионов, зачатых или клонированных в чашке Петри, вутробу — искусственный процесс. Это — любопытное замечание, учитывая, чтогаметы требуют такого же «активного, направленного и»искусственного" (в виде механического переноса) вмешательства"в первую очередь для того, чтобы попасть в чашку Петри. Если мы противискусственного переноса гамет из чашки Петри, то почему мы должны радоваться ихискусственному переносу в чашку Петри? На это отвечают: «Чтобы бесплодныепары могли иметь детей».

Создание эмбрионов для научныхисследований

Создание эмбрионов было позволенодля размножения рода человеческого. Но совсем другое дело — создаватьэмбрионов, чтобы ставить на них эксперименты. Во-первых, разрешение на созданиеэкспериментальных эмбрионов поднимает проблему инструментализации — созданиячеловеческой жизни исключительно в утилитарных целях. Во-вторых, клонированныеэмбрионы или полученные из них стволовые клетки имеют большую коммерческуюценность, а значит, встает проблема коммодификации людей — возможности торговличеловеческой жизнью. Создание эмбрионов в целях эксперимента подрывает принципсамостоятельной ценности человеческой жизни. Жизнь ценна сама по себе, а непотому, что из нее можно извлечь пользу при лечении болезни. США выступилипротив создания эмбрионов в научных целях, но предложили разрешить производствостволовых клеток из эмбрионов, не усыновленных после искусственногооплодотворения, поскольку «лишние» эмбрионы и выброшенные плодыобречены на неминуемую гибель, и мы не должны отказываться от их использованиядля пополнения медико-биологического знания и возможности оказать медицинскуюпомощь больным. Но разве эмбрион, произведенный путем клонирования, имеетменьшую ценность, чем эмбрион, порожденный слиянием яйцеклетки и сперматозоида?

Цель оправдывает средства?

Дляоправдания терапевтического клонирования привлекаются богословские иутилитарные аргументы. Высказывается мысль, что общество должно бытьзастраховано от наиболее очевидной опасности: от имплантации клонированногоэмбриона и, следовательно, появления детей-клонов. Однако следует разрешитьприменение методов, способствующих излечению диабета, болезни Паркинсона,болезни Альцгеймера, рака, сердечных заболеваний, артрита, ожогов и болезнейспинного мозга. Этика же не может оправдать терапевтическое клонированиечеловека. Во-первых, нельзя создавать эмбриона просто для того, чтобы другиелюди его использовали. Более того, если такие эксперименты окажутся успешными,то спрос на эмбрионы для удовлетворения человеческих нужд будет расти. К томуже, необходимо будет создавать экспериментальные эмбрионы, чтобы определить,будет ли от них медицинская польза.

Обратимся кпринципам исследований человека, на концепцию этики исследований человеческогоорганизма оказали влияние три плодотворных документа, касающихся этическихнорм. Это Нюрнбергский кодекс (1946-49 гг.), Бельмонтский доклад (1979 г.) иХельсинкская декларация (1964 г., поправки внесены в 2000 г.). Хотя каждый изэтих документов посвящён отдельным вопросам, из всех них вытекают общиеруководящие принципы. Научные эксперименты, равно как и исследования, должныбыть высочайшего качества. Предварительные эксперименты над животными должныдавать плодотворные и многообещающие результаты. Если для достижения целиприменим метод, не требующий экспериментов над людьми, то такие экспериментыпроводиться не должны.

Пока что все клонированные животные или рождаются сгенетическими аномалиями, или оказывают не в состоянии произвести на светздоровое потомство.

Специалисты-биологи спорят о возможных причинах этого настраницах журнала Science.

Сотрудники двух известных американских научных центровиспользовали мышей для того, чтобы понять, что же именно нарушается в работеорганизма при клонировании. Выяснилось, что у клонированных мышей ДНК измененаи не вполне соответствует нормальной. Некоторые из генов, как говорят ученые,«не включаются».

«Стало быть, можно предположить: даже клоны, которыекажутся здоровыми, рождаются с нарушениями генетического кода», — говоритодин из авторов исследования, профессор Рудольф Йенич.

«Экспериментировать на людях пока рано», — считает он.

Создатель Долли согласен

Такой же точки зрения придерживается и британский ученый ЯнВилмут — один из создателей известной во всем мире овечки Долли. В интервьюБи-би-си он заявил: «Клонирование людей приведет к тому, что младенцыбудут рождаться с серьезными отклонениями от нормы».

Очередным доказательством справедливости собственных словпрофессор Вилмут и считает результаты работ американских ученых.

«Пока что результаты клонирования мы можем предсказыватьтолько приблизительно, — говорит профессор Вилмут. — И неважно, идет ли речь омышах, овцах, коровах или, если уж на то пошло, о людях».

Кстати, в 2002 году у знаменитой Долли было отмеченоразвитие артрита, который, как предполагается, мог стать результатом генныхмутаций, инициированных процессом клонирования. Помимо артрита у животногонаблюдался целый ряд отклонений от нормального развития, и в феврале учёныеусыпили овечку из-за рака лёгких. Но опухоль могла быть и не вызвана процессомклонирования, за два года до кончины Долли умерла от той же болезни её соседкапо камере.

«Мы понимали, что животное вопасности, — говорит создатель Долли Йен Уилмут из Института Рослин вЭдинбурге. — Тем более что инфекции гораздо быстрее распространяются, когда овецсодержат в закрытых помещениях». Но спасать ценного клона почему-то не стали — в карантин не отправили.

Но возможно ли клонирование человека?

Учёныеиз США считают, что клонирование человека может оказаться неосуществимым побиологическим причинам. Они заявляют, что сотни попыток создать клонобезьяны провалились. По их словам, устройство яйцеклеток приматов, в том числеи человека, делает их клонирование практически невозможным. «Такимобразом, подтверждается тот факт, что шарлатаны, сообщавшие о клонированиичеловека, никогда не понимали клеточной биологии настолько хорошо, чтобыдобиться успеха», — заявил руководитель группы доктор Джеральд Шаттен.

Клонированию успешно подвергаютсянекоторые животные, в том числе мыши, овцы и другой скот, однако в последнеевремя появляются все более явные признаки того, что не все виды можновоспроизвести искусственным путем. Исследование, результаты которого былиопубликованы в журнале Science, усиливает сомнения в том, что заявлениякомпании Clonaid о создании первых человеческих клонов являются правдой. Этакомпания, созданная последователями уфологического культа раэлитов, сообщила орождении уже нескольких детей-клонов, однако до сих пор не предоставилаубедительных доказательств

Большинство ученых сходятся натом, что попытки создать клон человека опасны и сомнительны с моральной точкизрения. Многие клоны животных появлялись на свет с теми или иными отклонениями.Здоровыми они рождались редко, сообщает BBC.

Исследователи университетаПиттсбургской школы медицины попытались клонировать макаку-резус с помощьютехнологии, использовавшейся при создании клона знаменитой овцы Долли. Послесотен попыток им так ни разу не удалось добиться беременности у носителя клона.Другим группам ученым также не удалось клонировать обезьян. Судя по всему, уприматов при делении клонированных клеток ДНК не передается новым клеткамдолжным образом. Некоторые клетки в итоге получают либо слишком много, либослишком мало ДНК, и оказываются нежизнеспособными. Ученые полагают, что попыткиклонировать других приматов, в том числе и человека, скорее всего, обречены напровал.

Тем временем японские ученые утверждают, что нашлиальтернативу технике клонирования при выращивании отдельных органов.Исследователи из Института репродукции человека при Киотском университетеобъявили, что им впервые в мире удалось вернуть обычные клетки крови к томусостоянию, когда из них можно получить абсолютно любой трансплантант.

В ходе опытову лабораторных мышей изъяли лимфоциты и при помощи электрошока объединили их сзародышевыми стволовыми клетками — предшественницами всех взрослых тканей,составляющими «тело» эмбриона. Полученный гибрид пересадили впитательную среду и по прошествии короткого времени лимфоциты превратились вклубок клеток самой разной «ориентации». В нем были намешаныначальные формы костной, мышечной, нервной и прочих тканей. Оставалось тольковычленить необходимую клетку и создать условия для ее дальнейшего перерастанияв отдельный орган.

Как говорятученые, новая техника репродукции обещает прорыв в трансплантологии — донором вданном случае выступает сам же реципиент. Это также, по их мнению, позволяетобойти этические проблемы, которые возникают при клонировании, когда роль«фабрики запчастей для тела» играют зародыши-клоны.

Заключение

Итак,работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в начале   50-хгодов и интенсивно продолжаются вот уже более четырех десятилетий. Что касаетсяамфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несмотря назначительные достижения, проблема клонирования взрослых особей остается до сихпор не решенной. Установлено, что в ходе клеточной дифференцировки упозвоночных происходит или потеря определенных генных локусов или ихнеобратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та часть генома, котораяконтролирует не ранние, а более поздние этапы онтогенеза. Механизм этогоявления пока не поддается научному объяснению. Но очевидно, что дляклонирования взрослых позвоночных необходимо использовать малодифференцированныеделящиеся клетки.

Что касается этической стороны дела, то заповеди, которымичеловечество пользуется века, к сожалению, не предусматривают новыхзакономерностей и возможностей, какие вносит в нашу жизнь наука. Поэтому людями необходимо обсуждать и принимать новые законы общежития, учитывающие новыереальности.