Реферат: Биологическая фиксация азота

БЕЛОРУССКИЙГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологическийфакультет

Биологическая фиксацияазота.

                                                                                                                                      Рефератстудента 3 курса 6группы                                                       Ковальчука К.В.

Минск 2003г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение  ……………………………………………………………………………….3                                                                                                                          

Фиксация азота клубеньковыми бактериями.………………………………………...4

                                                                 

Биохимия азотфиксации………………………………….…………………………….5                                                                                                  

Применение азотфиксаторов на практике.………………….…………………………6                                                                                                    

Литература….……………………………………………………………………………7                                                                                                                     

                                                                                                                

Введение.

Азот является абсолютнонеобходимым элементом для всех живых организмов. Основным ре­зервуаром азотаслужит земная атмосфера.  Эукариотическиеорганизмы не способны усваивать азот непосредственно из атмосферы. Такойспособностью обладает ограниченное количество ви­дов прокариот, которыхназывают азотфиксаторами, а процесс связывания азота атмосферы (вос­становление<img src="/cache/referats/22928/image002.gif" v:shapes="_x0000_i1025"> до <img src="/cache/referats/22928/image004.gif" v:shapes="_x0000_i1026">этимиорганизмами — биологической азотфиксацией. Многие растения, животные и грибыспособны вступать в симбиоз с азотфиксирующими прокариотами. Наиболееинтенсивно азотфиксация протекает при образовании эндосимбиозов, когдамикроорганизм про­никает внутрь тканей или даже в клетки хозяина. При этоммикросимбионт обеспечивается пита­тельными веществами и энергией, необходимойдля разрыва тройной связи N2, а хозяин получает легко усваиваемый<img src="/cache/referats/22928/image006.gif" v:shapes="_x0000_i1027">Биологическаяазотфиксация представляет собой глобальный процесс, обеспечивающий существованиежизни на Земле. Общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17,2·<img src="/cache/referats/22928/image008.gif" v:shapes="_x0000_i1028"> т/год, что в четыре раза превышает связываниеN2 в форме NH3 на предпри­ятиях химическойпромышленности. При этом продуктивность симбиотической азотфиксации со­ставляет100-400 кг N/га.

Впервые прямыедоказательства наличия азотфиксирующих микроорганизмов, живущих в сим­биозе сбобовыми растениями, были получены благодаря работам немецкого исследователя Гер­манаГельригеля. Сравнивая источники азота для злаков и бобовых (1886 год), он показал,что если злаки черпают азот из минеральных веществ почвы, то бобовые, крометого, обладают спо­собностью фиксировать азот воздуха. Такую способностьбобовых Гельригель объяснял наличием на корневой системе клубеньков, развитиекоторых вызывают микроорганизмы. После работ Гельригеля стало ясно, чтофиксация растениями азота связана с микроорганизмами, инфицирую­щими корневуюсистему растения. Потребовалось около десятка лет для подтверждения выводовГельригеля о значимости симбиотических микроорганизмов рода Rhizobium длябобовых расте­ний как азотфиксаторов. Голландский бактериолог М. Бейеринк (M.Beijerinck) выделил в 1888 году клетки Rhizobium в чистой культуре. Вдальнейшем была показана их способность инфици­ровать корневую систему бобовыхс определенной степенью избирательности по отношению к конкретным видамрастений и вызывать образование на корнях клубеньков — специализированныхобразований, в которых протекает азотфиксация.

Сейчас известно около 13тыс. видов бобовых, многие из которых обладают способностью к симбиотическойфиксации азота. Для каждого вида бобовых растений имеются свои разновидно­сти(штаммы) Rhizobium, которые и получили свои названия от названий хозяина(Rhizobium trifolii — клубеньковые бактерии клевера, Rhizobium lupini — клубеньковыебактерии люпина и т.д.).

 Выяснено также, что водный папоротник Azollaнаходится в симбиотических отношениях с азотфиксирующими цианобактериями.Некоторые деревья и кустарники (например, ольха, обле­пиха, восковик) имеют вкачестве симбионтов актиномицеты. Поиск новых азотфиксирующих пар растение — микроорганизм далеко не закончен.

В 70-80-х годах нашегостолетия в лаборатории доктора Джоан Доберейнер (J. Dobereiner)  в Бра­зилии активизировались поискиазотфиксирующих микроорганизмов, обитающих на поверхности корневой системыдиких и культурных злаков. Такие микроорганизмы, живущие в ассоциации срастением, называются ассоциативными азотфиксаторами. Число их видов велико, ноблагодаря работам доктора Дж. Доберейнер и ее последователей в центре событийоказались микроорга­низмы рода Azospirillum. Азоспириллы легко инфицируюткорневую систему злаков и других рас­тений. Подобно Rhizobium, они делятся навиды, колонизирующие преимущественно те или иные сорта злаков, фиксируют азотвоздуха, могут продуцировать гормоны роста растений и обладают еще другимисвойствами, положительно влияющими на рост и развитие растений.

Кроме того, известны азотфиксирующие микроорганизмы, свободноживущие впочве, на рас­тениях, в воде. Впервые выделить культуру свободноживущихазотфиксирующих микроорганиз­мов удалось в 1893 году С.Н. Виноградскому. Онвыделил почвенный спороносный анаэробный микроорганизм, относящийся к родуClostridium, названный автором в честь выдающегося фран­цузского микробиологаЛ. Пастера Clostridium pasteurianum. В 1901 году М. Бейеринк выделил аэробноживущий почвенный микроорганизм Azotobacter, способный к азотфиксации, неприхот­ливыйпри выращивании. Этот микроорганизм интенсивно исследуют не только как удобнуюмо­дельную культуру, но и применяют в технологии обогащениясельскохозяйственных посевов био­логическим азотом. С тех пор коллекциисвободноживущих азотфиксаторов постоянно увеличи­ваются, особенно с 1949 года,когда в арсенал методов регистрации фиксации азота вошли метод изотопных индикаторов(<img src="/cache/referats/22928/image010.gif" v:shapes="_x0000_i1029">) иреакция восстановления ацетилена в этилен, катализируемая основ­ным ферментомсистемы азотфиксации — нитрогеназой. Тогда выяснилось, что способностью кфиксации азота обладают большинство аноксигенных фототрофных бактерий, многиецианобак­терии, некоторые бациллы, клебсиеллы и др.

Фиксацияазота клубеньковыми бактериями.

Наибольший вклад в биологическую азотфиксацию вносят клубеньковымибактериями (ризо­бии). Ризобии представляют собой грамотрицательные бактерии, образующиеклубеньки с расте­ниями семейства бобовых. Клубеньковые бактерии теперь делятна пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium(быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие).

В основе способностиинфицировать корневую систему хозяина лежит сложнейший и не вполне ясный молекулярныймеханизм, имеющий решающее значение в симбиотической фиксации азота. На первомэтапе происходит приближение микробной клетки к растению за счет ее способностипередвигаться в ответ на узнавание химических продуктов, выделяемых из корнейрастения (хе­мотаксис). Происходит контактное взаимодействие микроорганизма с растением. В этом процессеважное место отводится так называемому лектин-углеводному узнаванию растениямикроорга­низмом. Лектин корневых волосков растений (углеводузнающий белок)узнает углевод поверхно­сти бактерий и прочно связывается с ним. Происходитвзаимное узнавание партнеров и подго­товка к формированию симбиотическойсистемы. Растение в нано- или пикомолярных концентра­циях начинает продуцироватьспецифичные флавиноиды, которые активируют гены вирулентно­сти (Nod-гены)ризобий. Nod-гены кодируют синтез Nod-факторов (липоолигосахаридов), вызы­вающиху растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковоймери­стемы.  В месте резкого сгибаволоска пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку, черезкоторую бактерии и проникают внутрь. Вокруг этих бактерий образуется полость –инфекционная нить, стенки ее образованы растительными клетками, а внутреннее пространствозаполнено полисахаридами растения и микросимбионта.

Далее происходит эндоцитозризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазмерастительной клетки бактерии окружаются специальными перибактероидными мем­бранами(ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями.Коли­чество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений и обычносоставляет от 1 до 10 клеток. Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ,называются симбиосомой и являются основной структурно-функциональной единицейсимбиоза.

Вскоре ризобии в ПБМпреобразуются в особые симбиотические формы – бактероиды, имею­щие в три-пятьраз большие размеры, чем свободноживущие бактерии. Все это способствует фор­мированиюна поверхности корней клубеньков. Азотфиксирующий клубенек состоит из следую­щихчастей: а) инфицированная бактериями ткань, б) проводящая ткань, поставляющаяуглеводы и выносящая продукты азотфиксации, в) меристема, за счет которой идетрост клубенька. Морфо­логия и число клубенька строго определяетсярастением-хозяином, что возможно связано с боль­шой энергоемкостью ихобразования.

Клубеньковые бактерии болееэкономно используют энергию, необходимую для фиксации азота, затрагивая 3-4 гуглеводов на 1 г азота, в то время как свободноживущие азотфиксирующие бактериизатрачивают 50 — 100 и более граммов на фиксацию 1 г азота. Это связано с тем,что у
свободноживущих азотфиксаторов фиксация азота происходит в процессе их роста, ипотому большое количество энергии потребляется на этот рост. Кроме того, вцелях создания благоприятных условий для активности нитрогеназы — фермента,участвующего в фиксации азота, для снижения парциального давления кислорода усиливаетсядыхание, что связано с затратой энергии. Эти расходы энергии отсутствуют уклубеньковых бактерий, поскольку фиксация азота происходит в бактероидах,клетках, прекративших рост, а внутри клубеньков создаются благоприятные условия
для активности нитрогеназы, в том числе сниженное содержание кислорода. Оченьсущественно то, что фиксируемый клубеньковыми бактериями азот на  90 — 95% передается бобовым растениям.Бобовые, получая связанный азот от клубеньковых бактерий, не зависят или малозависят от обеспечения минеральным азотом почвы и потому могут успешнопроизрастать совместно
с другими растениями на почвах, бедных доступными формами азота.Количествоазота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, сильно варьирует отфитоценоза к фитоценозу, а в пределах конкретных фитоценозов может изменятьсяот года к году. Оно определяется участием
бобовых в фитоценозах, условиями среды и эффективностью соответствующих расбактерий. Для некоторых лугов в Новой Зеландии с травостоями, где преобладаетклевер, отмечена фиксация азотом до 450 — 550 кг/га.

Общий уровень азотфиксирующейактивности свободно живущих организмов невысок. В зависимости от вида и условийсуществования они накапливают в год от 10 до 30 — 40 кг связанного азота нагектар.

Биохимияазотфиксации.

Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами.Основным эле­ментом симбиоза является нитрогеназа – многомерный фермент,состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка. Нитрогеназы изразных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержаниемметаллов. Каждый из белков, в свою очередь, со­стоит из нескольких субъединиц.Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ нахо­дится в пределах200-250 кДа. Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и18-24 атома серы на одну молекулу. Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы. Нитрогеназа синтезируется вбактероидах и является ката­лизатором фиксации азота:

N2+ 8[H] + 2<img src="/cache/referats/22928/image012.gif" v:shapes="_x0000_i1030"><span Times New Roman"; mso-hansi-font-family:«Times New Roman»;mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type: symbol;mso-symbol-font-family:Wingdings">à

2 <img src="/cache/referats/22928/image004.gif" v:shapes="_x0000_i1031"> + H2

Этот процесс требует затратыэнергии. По расчетам для клеток Rhizobium восстановление одной молекулы N2требует затраты 25-35молекул АТФ, то есть на каждый грамм фиксированного азота расходуется три-шестьграмм органического углерода. Кроме АТР нужны также восстановленныепиридиннуклеотиды и ферредоксины в качестве восстановительной силы.

Нитрогеназа обладает низкойсубстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восста­навливать широкийспектр соединений, например, превращать ацетилен в этилен. Данная реакция применяетсядля определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом. Ацетилен вос­станавливаетсятолько до этилена, который легко поддаётся количественному определению с по­мощьюгазовой хроматографии.

Для активной работынитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия. Молекулярный кислород оказывает повреждающеедействие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O2Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к O2 определяетсяпрежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как всвязывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом можетпроисходить и ступенчатое восстановление O2 по одноэлектронномумеханизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидныеионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительноеповреждение нитрогеназы. Нитрогеназные белки являются не единственнымкомпонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O2.Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокислятьсяи подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

Микроаэрофильные условия вклу­беньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг кдругу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобныйбелок, синтезируемый растительными клетками). Леггемоглобин связывает O2, транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активностьклубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и при­дает им ярко-розовыйцвет. Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по оченьэкономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммо­ния или нитратов, он прекращаетработу.

Потребление растениями аммиака, образовавшегося при азотфиксации иливосстановлении нитратов почвы, осуществляется ферментами, связанными сбиосинтезом так называемых первич­ных аминокислот, прежде всего глутаминовой,аспарагиновой кислот и их амидов. Одним из ак­тивно изучаемых ферментовявляется, например, глютаминсинтетаза. Этот фермент катализирует реакцию

глутаминовая кислота+ NH3+ АТР <span Times New Roman";mso-hansi-font-family:«Times New Roman»; mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family:Wingdings">à

глутамин + ADP+ Pi

Этот ферментвстречается во всех организмах и принимает участие в присоединении аммиака к глутаминовойкислоте с образованием ее амида и последующим использованием его в различныхреакциях синтеза азотсодержащих органических соединений. Близким по механизмудействия яв­ляется и аспарагинсинтетаза:

аспарагиноваякислота + + NH3+ АТР <span Times New Roman";mso-hansi-font-family:«Times New Roman»; mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family:Wingdings">à

аспарагин + ADP+ Pi

Синтез аминокислоти амидов происходит с участием и других ферментов: глутаматдегидроге­назы,аспартазы и т.д. В конечном итоге азот в виде аминогрупп вовлекается в сериюбиосинтети­ческих реакций организма, поддерживая его жизненные функции.

Применениеазотфиксаторов на практике.

Открытие азотфиксаторовпривело к созданию так называемых микробных удобрений. Уже в 1895 году Наббе иХилтнером запатентован препарат микробной культуры Nitragin. Он выпус­кался в17 вариантах для различных растений. Препарат представлял собой культурыазотфикси­рующих микроорганизмов, смешанных с почвой, торфом, песком, навозом идругими субстра­тами. Внесение нитрагина в почву или обработка семян называлисьинокуляцией и позволяли фермеру повысить качество и количество продукции. Впервой половине XX века наблюдался не­уклонный рост научно-исследовательскихработ по созданию перспективных микробных препара­тов для бобовых и небобовыхкультур.

После второй мировой войныначался период химизации сельскохозяйственного производства и работы поисследованию микробиологических препаратов стали свертываться. Возможностибольшой химии, дешевизна азотных удобрений, простота их использования как быотодвигали на второй план микробные препараты. Однако выяснилось, чтоинтенсивное использование синтети­ческих азотных удобрений кроме положительногоэффекта (роста урожайности) несут в себе большую опасность. Происходитзагрязнение азотсодержащими веществами почвы, подпочвен­ных вод, рек и озер.Минеральные удобрения вымываются из почвы, выщелачиваются и стано­вятсявредными для человека соединениями — нитритами, нитрозаминами и т.д. поэтому впослед­нее время отдаётся предпочтение микробным препаратам.

Сейчас спектр применяемыхмикропрепаратов под бобовые, злаковые и другие культуры до­вольно широк. Штаммыризобий, используемые для инокуляции сельскохозяйственных бобовых культур,обычно выделяются из клубеньков этих же видов, однако в качестве источникатаких штаммов могут быть использованы и некоторые дикорастущие виды бобовых.

 В конце XX века во многих странахнитрагенизации подвергается 70-80 % бобовых культур. В районах традиционноговозделывания бобовых культур прибавка урожая от применения нитра­гина оставляет2-4 ц/га зерна сои, 1-2 ц/га зерна гороха и люпина, 80-100 ц/га зеленой массыбобо­вых культур, 6-12 ц/га сена клевера и люцерны. На почвах, где бобовыекультуры ранее не возде­лывались и в которых нет специфичных для них клубеньковыхбактерий, дополнительный сбор сельскохозяйственной продукции за счет примененияпрепаратов клубеньковых бактерий дости­гает 50-100 % и более.

Литература.

Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, 576 с.Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.: Изд-во МГУ, 1992, 448 с.  Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы // Соросовский образо­вательный журнал. 1998.