Реферат: Питательные среды в микробиологии

Белорусский ГосударственныйУниверситет

Биологический факультет

Питательные среды

студента 2-го курса

Бабицкого Мирослава

Минск 2003 г.

Классификацияпитательных сред.

При составлении питательных сред для микроорганизмов необходимо учитыватьих потребность в элементах питания. По составу питательные среды подразделяютсяна две группы: естественные (натуральные) и синтетические. Естественными обычноназывают среды, которые состоят из продуктов животного или растительногопроисхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. Основой такихсред являются различные части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи,овощи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников. Большинство изних используется в виде экстрактов или настоев. На естественных средах хорошоразвиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, обычно, всекомпоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределеннымсоставом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов,поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а сдругой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развитиямикроорганизмов. Это связано с тем, что состав естественных сред очень сложен;кроме того, он не является постоянным, так как существенно колеблется взависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на ростмикроорганизмов. Естественные среды неопределенного состава используютсяглавным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассыи для диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и такназываемые полусинтетические среды. В их состав наряду с соединениями известнойхимической природы входят вещества неопределенного состава. Синтетические среды— это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически  чистые соединения,взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды следует готовить надистиллированной воде. Для разработки синтетических сред, обеспечивающихнормальный рост изучаемого микроорганизма или максимальный биосинтезкакого-либо продукта его жизнедеятельности, необходимо  знать особенностиобмена веществ данного организма и его потребности в источниках питания. Внастоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количествосинтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным средамнеизвестного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой  набор компонентов, но могут быть и довольнопростыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследованияобмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих всреду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующиепродукты обмена. С. Н. Виноградским в практику микробиологии введены элективные(избирательные) среды для определенных групп микроорганизмов. Эти средыобеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы родственныхмикроорганизмов и менее пригодны или совсем не пригодны для развития других. Знаяфизиологические особенности соответствующей группы микробов, можно подобратьтакие условия культивирования (состав среды, ее активную кислотность, условияаэрации, температуру и др.), при которых будут развиваться лишь микроорганизмыэтой группы. Это позволяет вести различные биологические процессы в лабораториии в производстве без предварительной стерилизации среды. Такие средыприменяются главным образом для выделения микроорганизмов из мест ихестественного обитания, для получения накопительных культур. Понятие«элективные среды» входит в более широкое понятие «элективные условия». Питательныесреды применяют различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие. Плотныепитательные среды используют для учета количества бактерий, выделения их в чистуюкультуру и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5—2,5%агар-агара или 10—15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносятагар-агар в количестве 0,1—0,2%. По назначению среды разделяют на элективные идифференциально-диагностические. Элективные среды обеспечивают преимущественноеразвитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, дляпреимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточнымдобавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллическийфиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в средуможет быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этойконцентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первомэтапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительнойкультуры. Дифференциально-диагностические среды применяются для быстройидентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовойпринадлежности, в клинической бактериологии и др. Принцип построениядифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерийразличаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый наборферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. Всостав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательнаясреда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химическийсубстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данногомикроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которогосвидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы уисследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны,сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством. Основнымикомпонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод иосновной фусин, обесцвеченный сульфитом (реактивШиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, несбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы доацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развививается красная окраскасоответствующих колоний. Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) вкачестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена вчерно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенныев черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством,бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуютв среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществамипитательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок,исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексыкрасителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску.Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерийрода Proteus.

Составпитательных сред.

Агар-агар— растительный коллоид, получаемый изнекоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахаридыс ничтожным содержанием азотистых веществ. Желатина — кислый азотсодержащийпродукт, добываемый путем выварки костей и хрящей. В качестве плотныхпитательных сред широко применяют также гелевыепластины, введенные в микробиологическую практику С. Н. Виноградским. Длявыращивания микроорганизмов, использующих органические формы азота, частоупотребляют мясопептонные среды: мясопептонныйбульон, мясопептонный агар и мясопептонную желатину. Мясопептонный бульон(МПБ). Для приготовления мясо-пептонных средиспользуют мясной бульон, который получают так: 500 г мелко изрубленногосвежего мяса без костей, жира и сухожилии заливают в эмалированной кастрюле 1 лводопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч прикомнатной температуре или 1 ч при 50—55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживаютчерез марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидныхбелков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — черезбумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрываю!ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверхуколпачками из бума ги). Ватныепробки должны быть плотными, так как они являются фильтром, препятствующим проникновениюбактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован влюбое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, топредварительная стерилизация излишня. Нередко в лабораторных условиях мяснойнастой кипятят вместе с мясом, а затем мясо отжимают. Бульон получаетсяхорошего качества. Если желательно иметь мясной бульон особо высокойпитательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина иподкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин дополнительно гидролизует белковыесоединения мяса, и количество усвояемых бактериями питательных веществвозрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 лсреды. Для приготовления мясопептонного бульона к 1 л мясного бульона добавляют5—10 г пептона (пептон — первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярноймассой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью созданияосмотической активности. Среду нагревают до растворения пептона, постояннопомешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды,приливая 20%-ный раствор NagCOa (до посинения влажнойкрасной лакмусовой бумажки; при этом фенолфталеин еще не показывает щелочнуюреакцию — при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска невыявляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1—2 капли его вносятстеклянной палочкой в фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона. В нейтральнойсреде бромтимолблау бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий. Послеустановления реакции среду снова кипятят 5—10 мин и белки, свернувшиеся отизменения реакции, отфильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульонаили осветлив его белком. Прозрачный Мясо-пептонный бульон разливают в пробирки,закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин. Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 лмясо-пептонного бульона добавляют 15—20 г мелко нарезанного агар-агара. Средунагревают до растворения агара (температура плавления его 100°С, застывания—40°С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2COa ичерез воронки разливают в пробирки (но 10 мл для разливок в чашки — агарстолбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливеагара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробкиприлипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120°С втечение 20 мин. Мясо-пептонная желатина(МПЖ). В 1 л мясопептонного бульона помешают 100—150 г желатины. Температураплавления зависит от процентного содержания в среде. 10%-ная желатина плавитсяпри 24°С, 15%-пая — при 25°. В летнее время среды готовят, добавляя 15%желатины. После растворения желатины при осторожном нагревании в средеустанавливают слабощелочную реакцию (как и для МПБ и МПА), кипятят в течение5мин, затем охлаждают -до 40—50°С. Одновременно яичный белок взбивают снебольшим количеством воды, вливают его в охлажденную желатиновую среду, хорошовзбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков становитсяпрозрачной. Ее фильтруют через горячую воронку, разливают в пробирки истерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду по 30 мин через24 ч 3 раза.

Картофельный агар. 200 г очищенного и промытого водойкартофеля нарезают ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин.Отвар фильтруют через вату и доводят до первоначального объема. К полученнойжидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его растворения и устанавливаютнейтральную реакцию среды (рп 7,0). Среду стерилизуютпри 1 атм в течение 20 мин. Пивное сусло. Зерна ячменя замачивают в холодной воде ипроращивают при 35°С. После того как ростки будут вдвое больше длины зерна,последнее высушивают до воздушно-сухого состояния (можно при слабом подогревании)и получают солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и 250 г егоберут на 1 л воды. Смесь подогревают при 57°С (для лучшего выделения ферментаамилазы) до исчезновения реакции на крахмал (синее окрашивание с йодом). Пробына осахаривание крахмала проводят в фарфоровой чашкев капле жидкости. Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бумажныйфильтр. Такое сусло содержит 10— 20% сахара. Определив его содержание поплотности раствора с помощью сахариметра, сусло разбавляют водой доконцентрации сахара 6—8%, стерилизуют при 115°С (давление 0,5 атм) в течение 30 мин. Готовое сусло можно получить напивоваренном заводе. Сусло-агар. Кприготовленному суслу добавляют 2,5—3% агара, кипятят до его расплавления,фильтруют через вату и стерилизуют таким же способом, как пивное. Обезжиренное молоко. Для приготовленияпитательных сред употребляют снятое молоко, так называемый обрат (жир в молокенеблагоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов). Обрат получаютсепарированием молока, нагретого до 34°С. Жир можно удалять и при отстаиваниимолока. При стерилизации молока следует учитывать, что его нельзя длительноевремя выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся вмолоке, может карамелизоваться. Обезжиренное молоко разливают в стерильныепробирки и выдерживают при 115°С (давление 0,5 атм)15 мин. Перед стерилизацией кислотность обрата не должна превышать 22° Тернера,иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают трое суток втермостате при 30°С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и другихстойких к нагреванию форм. Через 3 дня каждую пробирку с молоком просматриваюти пробирки, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают. При стерилизациив автоклаве иногда наблюдается побурение молока вследствие карамелизациимолочного сахара и пептонизации казеина. При длительной стерилизации на днопробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться.Перегретое побуревшее молоко    вкачестве    среды   использовать нельзя. Дрожжевые среды. Дрожжевая вода. 50—100 г сухих дрожжей размешивают в 1 л воды,кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром пополчаса в течение трех дней ежедневно. Дрожжевойавтолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, добавляют 2 гNa2HPO4, 1 н. раствор NaOH (до рН 6,1) и 5 млхлороформа, выдерживают при 37°С двое суток, доводят до рН 7,4, кипятят 30 мин,фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115°Сполчаса. Дрожжевой экстракт. 1 кгпрессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, триждыотфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115°С 30 мин. Бобовый отвар. 50 г фасоли (лучшебелой) заливают 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы неразварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 гсахара и доводят до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакциюсреды, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при давлении пара 1,5 атм в течение 30 мин.

Элективноекультивирование.

Познанием многообразия микроорганизмов мыобязаны двум обстоятельствам. Некоторые микроорганизмы уже сравнительно давнопривлекли к себе внимание вследствие того, что они образуют колонии илископления или же вызывают какие-либо заметные изменения в окружающей среде.Многие из таких, легко обнаруживаемых микроорганизмов поддаются прямомувыделению; относите л ьпо нетрудно подобрать условия,которые обеспечивали бы их рост. Существуют, однако, и многие другиемикроорганизмы (различных физиологических типов), ставшие доступными дляисследования лишь после того, как Виноградский и Бейерипк разработали техникунакопительных культур. И в принципе и на практике метод очень прост. Подборомряда факторов (источники энергии, углерода и азота; акцептор электронов; свет;температура; рН и т. п.) создают определенные условия и инокулируют средусмешанной популяцией, какая имеется, например, в почве или в иле. В такой среденаиболее хорошо приспособленный к пей тип микроорганизмов растет и вытесняетвсе остальные, сопутствующие, организмы. Посредством многократных пересевов вжидкую среду такого же состава и рассева по такой же плотной среде можно безтруда выделить накопленный штамм. Частый пересев с жидкой среды на жидкуюпредотвращает рост сопутствующих организмов, которые могли бы использоватьпродукты выделения или даже автолиза клеток первичной культуры и расти за счетних. Прекрасным материалом для инокуляции служат пробы из тех мест, где ужеимеется «естественное обогащение». Так, можно выделять микроорганизмы,использующие окись углерода, из сточных вод газовых заводов; микроорганизмы,использующие гемоглобин, — из сточных вод боен и бактерии, окисляющиеуглеводороды, — из нефтеносных пород, из почв, загрязненных нефтью, и изнефтяных отстойников. Метод накопительных культур позволяет выделятьмикроорганизмы с любой комбинацией потребностей в питательных веществах приусловии, разумеется, что искомый тип вообще существует в природе. Для крайнеспециализированных микроорганизмов особенно легко создать элективные условия.Так, минеральная среда, не содержащая связанного азота, на свету строгоизбирательна для «сине-зеленых водорослей, фиксирующих N2. Если ту жесреду дополнить органическим источником энергии и углерода, то на ней в темнотев аэробных условиях будет развиваться Azotobacter, апри исключении доступа воздуха — Clostridium. Для успешного получениянакопительных культур требуется ограничиться удовлетворением минимальныхпотребностей только того микроорганизма, который хотят выделить. Если,например, хотят выделить бактерии, способные окислять метан или водород снитратом или сульфатом в качестве акцептора водорода, то следует позаботитьсяоб исключении доступа кислорода, иначе будут доминировать аэробные формы,окисляющие метан или водород. Для отбора можно также использовать устойчивостьили толерантность микроорганизмов к кислотам и щелочам, к высоким температурампли излучению. Нередко наряду с «положительной» селекцией проводится и«отрицательная»— при помощи избирательно действующих ингибиторов. Напитательной среде, содержащей азид, в аэробных условиях растут, например,молочнокислые бактерии, а рост других аэробных микроорганизмов подавляется.Азид, цианид и H2S оказывают избирательное действие па те аэробные организмы, вдыхании которых участвуют цитохромы. В медицинскойдиагностике пользуются избирательным подавлением для обнаружения Corynebacterium diphtheriae(применение питательных сред, содержащих теллурит) ипатогенных Enterobacteriaceae (агаризованныесреды с добавлением висмута). В посевном материале могут присутствоватьразличные штаммы с одинаковым типом обмена веществ, отличающиеся друг от другалишь незначительно, например лишь по оптимальному значению рН или по скоростироста. Если для получения накопительной культуры использовать такой материал,то доминировать будет наиболее адаптированный к данным условиям или наиболеебыстро растущий штамм, все же остальные будут подавлены и выделить их неудастся. Поэтому в тех случаях, когда хотят выделить максимальное числоштаммов, растущих при определенных элективных условиях, посев следует проводитьнепосредственно в чашки. На плотных элективных средах штаммы, которым условияблагоприятствуют, образуют колонии. При достаточно большом расстоянии междуколониями конкуренция за питательные вещества не может иметь места; штаммы,растущие более медленно, не подавляются растущими быстрее, так что те и другиемогут быть выделены раздельно. В этой обзорной таблице объединены данныеотносительно получения накопительных культур у микроорганизмов с разными типамиобмена веществ. Чистую культуру микроорганизма (последний этап выделения)получают обычно па (или в) плотной питательной среде. Процедура начинается сотделения от популяции клеток одной-единственной клетки. Обязательное требованиесостоит в том, чтобы вырастающая из клетки колония оставалась изолированной отдругих клеток или колоний. Аэробные бактерии выделяют либо по методу Коха —рассевая суспензию по поверхности среды в чашках, либо, что легче, размазываякаплю платиновой петлей по агаризованной среде. Анаэробные бактериисуспендируют в расплавленном агаре с температурой 45°С и проводят инкубацию бездоступа воздуха. Тщательное отделение одной колонии, повторное суспендированиев жидкости и повторное нанесение мазка или разведение в агаре позволяютполучать чистые культуры большинства микроорганизмов.

Литература: Е.З Теппер и др.«Практикум по микробиологии» М. «Колос» 1979

Г. Шлегель «Общая микробиология» М. «Мир» 1972.