Реферат: Культивирование вирусов

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...............................................................................................................................3

1. <span Times New Roman""> 

Видыкультурклеток........................................................................................................4

2. <span Times New Roman""> 

Питательныесреды..........................................................................................................6

3. <span Times New Roman""> 

Получениеклеточных культур...............................................................................…9-18

3.1. Приготовление первичныхклеточных культур………………………................…9

3.2. Получение монослойныхперевиваемых культур клеток......................................10

3.3. Роллерное культивированиеклеток.......................................................................11

3.4. Суспензионноекультивирование клеток...............................................................13

3.5. Культивирование клеток намикроносителях……………………………………..16

4. <span Times New Roman""> 

Выращиваниевирусов в культурахклеток..............................................................19-24

4.1. Предосторожности при работес зараженными вирусами клетками....................20

4.2. Обнаружениевирусов.............................................................................................21

4.3. Культивированиепикорнавирусов на примере получения полиовируса

типа 3 в культуре клеток HeLa................................................................................24

Списоклитературы.............................................................................................................25

ВВЕДЕНИЕ

Для количественного накопления вирусов наиболееудобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивированияклеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Этиотрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособноститканей и клеток в искус­ственных условиях и положили начало глубоким науч­нымисследованиям тканевых культур.

Большая заслуга в деле paзработки методов куль­тивирования тканейпринадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток жи­вотныхв искусственных условиях и тем самым проде­монстрировал их «бессмертность» исходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов вэтом направлении достигла группа иссле­дователей под руководством Эрла. Они первыеполучи­ли рост большого числа клеток на стекле и в жидкой пе­ремешиваемойсуспензии. Появление антибиотиков и ус­пехи в создании искусственныхпитательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для ре­шенияразличных вопросов биологии и медицины. Од­нако лишь успехи в областивирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стиму­ломих развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить рядтеоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия«вирус-клетка». Кроме того решение целого ряда прикладных задач,связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусныхинфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

1. ВИДЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК.

Перенесение клеток целостного организма в условияжизни invitroпрекращает существование их как одного измногочис­ленных структурных элементов ткани или органа, в состав ко­торых ониранее входили. При этом клетки выходят из-под конт­роля нейро-гуморальныхфакторов и приобретают ряд особен­ностей, зависящих как от самого фактаотторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования invitro.<span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»">

Живущие вне организма клетки или тканихарактеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и гене­тическихчерт, резко отличных от свойств клеток органов и тка­ней invivo.<span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»">

В зависимости от методики первичной эксплантацииткани и техники ее культивирования различают несколько видов пе­реживающих ирастущих культур тканей и клеток. Наиболь­шее распространение имеютоднослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно онисоставляют основу современной лабораторной и производственной вирусологиче­скойпрактики.<span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»">

Различают два основных вида однослойных клеточныхкуль­тур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, по­лученнуюнепосредственно из тканей че­ловека или животных в эмбриональном илипостнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествииопределенного времени в них возникают явления неспецифиче­ской дегенерации, чтовыражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утратесвязи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Перио­дическаясмена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишьнесколько увеличить сроки жизни пер­вичной клеточной культуры, но не могутпредотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этотпроцесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток,выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостноморганизме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фонедегенерации большей части клеточного пласта могут со­хранить способность кросту и размножению. Эти клетки, об­наружив потенцию бесконечного размножения invitro,при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым терминомобозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и,как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевивае­мыеклетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни invitro.Появление и тех, и дру­гих клеток связано с процессом отбора в клеточной популяциипервичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммовперевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по срав­нению слюбой первичной культурой, состоит в потенции неог­раниченного размножения внеорганизма и относительной автономности сближающей их с бактериями иодноклеточными простейшими.

Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению invitroзнаменует собой качественный скачок, в результатекоторого клетки приобре­тают способность к автономному существованию, подобномик­роорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах.Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей,называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур —трансформированными.

Усовершенствование техники культивирования клеток зна­чительнорасширило возможности получения перевиваемых кле­точных линий из самыхразнообразных тканей животных и че­ловека. При этом не был обнаружен возрастнойпредел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неог­раниченномуросту invitro,т.е. к трансформации.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являютсязлокачественные новообразования. В этом случае трансформа­ция клеток происходитinvivoв результате развития патологи­ческого процесса,этиология которого во многом остается еще невыясненной.

Не все злокачественные новообразования способны давать началоперевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попыткиполучить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных железчеловека. С тру­дом удается адаптировать к жизни invitroклетки плоскокле­точного рака кожи и слизистых. С другойстороны, сравни­тельно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачест­венныхопухолей нервной системы.

Особую категорию клеточных культур составляют полупере­виваемыештаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе чертыпервичных и перевиваемых клеток.

2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

В любой клеточной культуре различают клеточную ижид­кую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность кле­ток культуры ипредставляет собой питательные среды различ­ного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовыеи под­держивающие. В составе ростовых сред должно содержаться большепитательных веществ, чтобы обеспечить активное раз­множение клеток дляформирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрациюклеточных эле­ментов в суспензии (при получении суспензионных культур).Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток вуже сформированном монослое при раз­множении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны.В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости,сыворотки животных), так и субстраты, полу­ченные в результате частичнойобработки естественных продук­тов (эмбриональные экстракты, гидролизатлактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические хи­мическичистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера питательной среды, полностьюсостоя­щей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложеннуюдля выращивания клеточных культур из почеч­ного эпителия обезьян. В эту средувходит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) икоровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, ихиспользова­ние связано с большой опасностью микробной и вирусной конта­минацииклеточных культур. В связи с этим и происходит по­степенное вытеснение ихсинтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находятсинтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащиестрого определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные средыдля тка­невых культур конструируются на основе какого-либо сбалан­сированногосолевого раствора с достаточной буферной ем­костью. Чаще всего ими являютсярастворы Хенкса и Эрла. Эти   растворы —обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентомбольшинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья,лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формированиемонослоя не происходит.

Включение сыворотки в то же время препятствуетсозданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развитияфундаментальных исследований по клеточной фи­зиологии, так как вместе ссывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемыхфакторов, варьи­рующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы EwansиWaymouthбыли предложены бессыво­роточные среды точногохимического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателейпролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлениемсывороток. В  связи с этим  представляет интерес работа Birch  и Pirt, показавших,  что для  обеспечения интенсивного  роста клеток вбессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС12.

В ростовые питательные среды, а так же в буферныйраствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в средунепосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствораантибиотиков на 500 мл среды.

Ниже приведен состав и метод приготовления однойиз распространенных питательных сред.

 Среда Игла

1. <span Times New Roman""> 

л-аргинина- 17,4

2. <span Times New Roman""> 

л-цистина- 4,8

3. <span Times New Roman""> 

л-гистидина  — 3,1

4. <span Times New Roman""> 

л-изолейцина- 26,2

5. <span Times New Roman""> 

л-лейцииа  — 13,1

6. <span Times New Roman""> 

л-лизина- 14,6

7. <span Times New Roman""> 

л-метионина- 7,5

8. <span Times New Roman""> 

л-фенилаланина- 8,3

9. <span Times New Roman""> 

л-треонина- 11,9

10. л-триптафана — 2,0

11. л-тирозина — 18,1

12. л-валина — 11,7

13. биотина — 0,24

14. холина — 0,12

15. холин-хлорида — 0,14

16. витамина В12(птероилглютаминовой кислоты) — 0,44

17. никотинамида  — 0,12

18. пантотеновойкислоты — 0,22

19. пантотенатакальция — 0,48

20. пиридоксаля(пиридоксин хлоргидрата) — 0,20

21. тиамин-хлоргидрата- 0,34

22. рибофлавина — 0,04

23. хлористогонатрия — 5850,0

24. хлористого калия- 373,0

25. фосфата натрияоднозамещенного (NaH2PO4. Н2О) — 138,0

26. кальцияхлористого — 111,0

27. двууглекислогонатрия (NaHCO3)- 1680,0

28. магнияхлористого (MgCl2. 6Н2О) — 102,0

29. глюкозы — 900,0

30. л-глютамина — 146,2—292,3

31. пенициллина — 50,0

32. стрептомицина — 50,0

33. фенола красного- 5,0

34. воды  до 1000,0

Приготовление.

Раствор 1. В500 мл воды, нагретой приблизительно до 80°, помешивая, растворяют указанныевыше количества аминокислот, после чего добавляют л-глютамин и фенол-красный.

Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяютнеорганические соли, за исключением дву­углекислого натрия (NaHCO3),смешивают с предыдущим раствором неорганических солей и добавляют биотин и витаминB12.

Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют всевитамины, кроме биотина и птеро-илглютаминовой кислоты, и антибиотики —пенициллин и стрептомицин. Все растворы стерилизуют фильтрованием черезстеклянный фильтр-нутч (пори­стая стеклянная пластина, величина пор 0,7—1,5 <img src="/cache/referats/5087/image002.gif" v:shapes="_x0000_i1025">

500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 млраствора 3 смешивают и доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1мг инозита на 1 л.

3. <span Times New Roman""> 

ПОЛУЧЕНИЕКЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

3.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ  КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

Первичной- называется культура, полученная из ткани и выращивае­мая invitroдо начала субкультивирования, то есть до первого посева.Первич­ная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, по­сколькуне все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить invitro. В процессе культивирования клеток происходит относительноеобеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.

Напервом этапе получения первичной культуры проводят стерильное удалениефрагмента ткани, органа животного и его механическую или фер­ментативнуюдезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 — 3 мм, кусочки тканиотмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибио­тиками. Для дезагрегацииткани используют трипсин (0,25% неочищенный или 0,01 — 0,05% очищенный) иликоллагеназу (200 — 2000 ед/мл, неочищен­ная) и другие протеолитическиеферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток.

Первичные культуры могут быть также получены от кусочковткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодарясобственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгусткаплазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагмен­тов. Клетки,  мигрирующие из эксплантатов могутиспользоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся нановые чашки, миг­рирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена итрипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты.

Известны такие первичные культуры, как культурафибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты.

3.2. ПОЛУЧЕНИЕМОНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК.

Как уже отмечалось выше, одним из методовполучения перевиваемых клеточных ли­ний является отбор клеток с повышеннойактивностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можноосуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первичнотрипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошосформированным клеточным моно­слоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и недолжны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную длясистематической смены ростовую среду разливают по не­большим сосудам (чтобыисключить бактериальное загрязне­ние) и хранят при t — 4°.

Смену среды производят регулярно, не реже 1 разав не­делю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 — 30% объема ростовойсреды, в течение следующих 3 — 4 недель — 50 — 60%, позднее проводят полнуюсмену среды. Свежую среду непосред­ственно перед работой подогревают до t — 37°.

По мере смены сред клетки меняют свою морфологию.Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается кцентру, и монослой приобретает звездча­тый вид. Сами клетки при этом несколькоудлиняются. Через 7 — 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появ­лятьсяновые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разнуюморфологию.

В культуре клеток почки куриного эмбриона вцентре моно­слоя или между стянутыми его участками появляются округ­ленныеклеточные элементы, из которых постепенно формиру­ются скопления в виде небольшихколоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования,напомина­ющие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкиепрозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колонийтакже почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, нотакже на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтомуобязательным условием при смене питательной среды является поддержание еепостоянного объема. В культуре клеток почек эмбриона человека на фоне массовойдегенерации стянутого в тяжи монослоя выявляются крупные полигональные клетки сдлинными отростками.

Возникшие в процессе отбора атипичные клеточныеэле­менты должны быть отделены от остальных участков монослоя и перенесены вотдельные пробирки или матрасы. Для этого может быть использован методверсенизации или механиче­ский откол атипичных клеток с помощьюбактериологической петли или шпателя. Последний способ особенно необходим приработе с культурой клеток почек обезьяны, где колонии атипич­ных клеток плотноприкреплены к стеклу и сами от него не от­деляются.

При смене питательной среды в случае появленияатипичных клеток рекомендуется осторожно удалить большую часть рос­товой среды,а меньшей частью энергично отполоскать монослой и эту среду разлить попробиркам. В этом случае в среде могут оказаться атипичные клетки, обладающиеспособностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.

После переноса культуры атипичных клеток в новуюпосуду наблюдение за основной культурой целесообразно продолжить, так какпроцесс выведения новой клеточной линии весьма сло­жен, и далеко не всегдаотобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии перевиваемыхклеток. Необхо­димо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий,продолжающаяся в течение многих месяцев, проводилась с од­ними и теми жепитательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.

Известны такие первичные культуры, как культураклеток почки золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горногокозерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).

3.3. РОЛЛЕРНОЕКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

Донедавнего времени ткане­вые культуры применялись в вирусологии преимущественнов виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращива­нияклеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использованииоднослойных стационарных культур встречается ряд трудно­стей, связанных согромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, болеевыгодны роллерные культуры, которые эко­номичны, характеризуются оптимальнымотношением полезной площади культивирования к объему питательной среды иоткрывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.

Термин «роллерные культуры» обозначает методкультивирования, при котором клеточный монослой располагается по всейцилиндрической поверхно­сти горизонтально вращающихся сосудов и периодическиомывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количествоклеток может в от­дельных случаях быть взвешено в культуральной среде. Вподобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной.«Урожайность» клеточной культуры будет тем больше, чем большеплощадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные путиувеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление иразмножение клеток. Для этого приме­няли различного характера основы с большойудельной поверхностью: твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянныхспиралях и т. д. Широкого рас­пространения эти методы не получили, так какзначительно затрудняли манипу­ляции с клетками, но следует отметить описаннуюЛ. С. Ратнером и В. А. Крику­ном методику многоярусного культивирования. Клеткикультивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальнымистеклянными труб­ками, расположенными параллельно продольной оси сосудов.Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойнымикультурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2этапа. На пер­вом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с цельюравномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись кстеклу, культивирование продолжалось в стационарном положении. Описаннаякультуральная система была успешно использована для культивирования вирусаящура.

Болееэффективным оказалось вращение сосудов, в которых происхо­дило размножениеклеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с развитием техническогооснащения возросли объемы культуральных сосу­дов, и от выращивания клеток вовращающихся пробирках исследователи перешли к вращающимся бутылям. Роллерныекультуры стали применяться как для накопления клеток, так и размножениявирусов.

Для роллерного культивирования используютсяспециальные стеллажно-ярусные аппараты для вращения бутылей или барабаны. Чащевсего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производст­венныхусловиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для роллерногокультивирования просты, надежны и обслуживание их не­сложно. Большое значениеимеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы непрепятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительноенахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разныхавторов скорости вращения бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин.Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость вращенияфлаконов в пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. послеза­сева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0 об/мин)для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкуюскорость вращения (20—30 об/час).

Посевнаяконцентрация в 1 мл среды составляет для клеток СПЭВ, ВНК-21, HeLa, L — 60-80 тыс., для диплоидных клеток 100-200 тыс., для первичных культур — 200-300 тыс. Объем ростовой среды должен составлять 1/10, 1/20 часть объемароллерного флакона. Роллерный метод культивиро­вания позволяет получить большееколичество клеток. Так, с флакона емко­стью 3 л можно получить урожай клетокHeLa в 8 раз, ВНК-21 — в 9 раз, АО — в 11 раз больший, чем с монослойнойстационарной культурой флакона ем­костью в 1 л. Кратность экономии сред прииспользовании 3-литровых фла­конов составляет для клеток HeLa 2,8; ВНК-21 — 5,0, АО — 4,0. Способно­стью к росту и размножению в роллерных условияхобладают субкультуры, перевиваемые культуры и реже первичные, а такжедиплоидные штаммы клеток. Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратахнеобхо­дима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный методкультивирования позволяет получить большие количества клеток. Преиму­ществомроллерных культур по сравнению с традиционными стационарны­ми культурамиявляется, в частности, более экономичное использование питательных сред и болеевысокий выход вирусного антигена (на 1—2 lg).

 

3.4. СУСПЕНЗИОННОЕ   КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

В 1953 году Оуенс с со­трудниками впервые показалспособность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированномсостоянии. С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает вниманиеисследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении большихколичеств клеток. Ока­залось, что клетки перевиваемых линий, в отличие отостальных типов кле­точных культур, могут длительно культивироваться вовзвешенном состоя­нии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь кстенкам культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаряпостоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращива­ния клетки всуспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «уро­жай», чем встационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеютнеодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и анеуплоидныепостоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий, адаптируются быстрее кросту в суспензии.

Суспензионныекультуры готовят из однослойных культур. Клетки от­слаивают от стекла с помощьюрастворов версена и трипсина. Осадок клеток по­сле центрифугирования (1000об/мин.) ресуспендируют в свежей питательной среде. Приготовленную суспензиюпомещают в культуральные сосуды (реакто­ры, ферментеры) и выращивают припостоянном перемешивании. В научных исследованиях концентрация клеток висходной суспензии колеблется от 0,3 до 10х10 в 1 мл. Оптимальная концентрацияклеток в исходной суспензии должна быть 2-5х10 в 1 мл. По мнению Эрла и егосотрудников, концентрация клеток в суспензированной культуре должна быть такой,чтобы фаза логарифмического роста наступала не позднее 16-24 часов послеприготовления культуры. Суспен­зионные клеточные культуры проходят характерныестадии: лаг-фазу, фазу лога­рифмического роста, стационарную фазу и фазулогарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клетокуменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическаястадия роста), в третьей ста­дии увеличения количества клеток не наблюдается(стационарная фаза). Если культивирование продолжить дальше, то обнаружитсяпериод уменьшения чис­ленности клеток-фаза логарифмического отмирания (фазаразрушения). Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста выражаютвременем генера­ции. Под временем генерации имеется в виду период, необходимыйдля удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клетокважным условием является перемешивание жидкости, которое должно бытьнепрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенномсостоя­нии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в тоже время не вызывать их механического повреждения.

Перемешиваниесуспензионных культур проводят лопастными магнитны­ми мешалками, а такжекруговыми качалками. В настоящее время широко при­меняют вращение флаконов ибутылей вокруг продольной оси (15-40 об/мин). На магнитных мешалках скоростьвращения составляет 100—200 об/мин. Скорость перемешивания зависит от объемакультуры; малые объемы культуры требуют невысокой скорости, тогда как еенеобходимо увеличить при больших объемах. Для предотвращения оседания клеток навнутренней поверхности сосуда произ­водят силиконирование. Силиконовое покрытиев силу своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда.

Внутренниестенки культурального сосуда смачивают 5% или 10%-ным раствором силикона ипосле испарения растворителя (бензолового, аце­тонового) сосуды выдерживают при85°С и 200° (соответственно в течение 30 и 60 мин). После охлаждения сосудынаполняют горячей бидистиллированной водой и оставляют на 2 часа, затем их 3раза ополаскивают бидистиллированной водой и высушивают при 100°С. Сосудыстерилизуют в сушильном шкафу при 170°С в течение 2 часов.

Максимальныйрост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2. Питательные среды, применяемыедля выращивания клеток в суспензии, не отличаются от сред, используемых длявыращивания клеточных линий в однослойной культуре. Чаще всего прикультивировании клеток в суспензи­ях берут среду Игла с двукратнойконцентрацией аминокислот и витаминов.

Суспензионныекультуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем монослойные. В процессе потребленияглюкозы клетки выделяют в среду токсичную для них молочную кислоту. Потреблениеклетками глюкозы и выработка молочной кислоты идут параллельно и находятся впрямой зави­симости от плотности клеточной популяции. Полезным оказалосьприбавле­ние к питательной среде инсулина в количестве от 40 до 200 ЕД на 1 л.При­бавление к питательной среде инсулина изменяет соотношение междуколичеством поглощенной глюкозы и выделенной молочной кислоты. Для кле­токлинии Lуказанный коэффициент может бытьснижен с 74-81 до 37-38%.

Различныеаминокислоты потребляются из питательной среды рас­тущими клетками снеодинаковой скоростью. Отмечено, что регулярное прибавление аргинина (20-40мг/л) и увеличение количества глутамина до 450 мг/л благоприятствуют ростувзвешенных культур.

Прибавлениеинозитола (0,4 мг/л) позволяет ускорить рост культур амниотических клетокчеловека. Желательным является добавление к среде каталазы (1 мг/л) и тироксина(12 мг/л).

Большойинтерес представляют работы, посвященные получению взвешенных культур клеток всинтетической среде, не содержащей сыворотки крови. Предпринимаются попыткиувеличить вязкость питательной среды за счет безбелковых ингредиентов. С этойцелью используется метил-целлюлоза и гиалуроновая кислота.

Метилцеллюлозав концентрации 0,1-0,2% обладает максимальным за­щитным действием на взвешенныев среде клетки. Протективное действие метилцеллюлозы заключается в том, чтомолекулы образуют защитный слой вокруг клетки, предотвращающий повреждениеклеток при перемешивании среды. Весьма важным показателем состояниясуспензионной культуры является парци­альное давление кислорода в жидкой фазе.Концентрация кислорода в газовой фазе зависит от плотности клеточной популяциии нередко бывает ниже атмо­сферной. Недостаток кислорода ведет к появлениюгрануляции цитоплазмы, клетки теряют правильную округлую форму. При небольшомизбытке кислорода клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, истановятся очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода.Оптимальная концентрация кислорода для различных клеточных культур находится впределах от 9 до 17% или 293 мм рт. столба. При концентрации кислорода выше 20%про­исходит ингибиция клеточного роста. Так, при концентрации кислорода 24% раз­множениеклеток почек эмбриона кролика (линия ERK) снижалосьнаполовину, а при 30% сводилось к нулю. Повышение концентрации кислородатоксически воздействует на клеточный метаболизм.

Такимобразом, размножение клеток в суспензии зависит от концен­трации клеток висходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питатель­ной среды, способаперемешивания, объема суспензии и других факторов.

Однородностьсуспензии, возможность длительного поддержания клеток в логарифмической фазероста, перспективы математического моде­лирования процессов клеточного роста взависимости от влияния факторов внешней среды, удобство многократногоисследования физиологического состояния культуры клеток в суспензии, высокаяэкономичность метода -вот далеко не полный перечень преимуществ суспензионныхкультур.

Суспензионные культуры широко используется ввирусологических исследованиях и для накопления больших количестввируссодержащего ма­териала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов.

3.5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ.

В1967 г. VanWerelпредложил метод культивирования, сочетающий эле­ментымонослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом«микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепля­ются иразмножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроноси­телей» (МН),которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, напримермешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм может поместиться 350-630(или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколькотысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до                50 см2/мл.

Инокулированныев культиватор клетки прикрепляются к по­верхности частиц МН и размножаясь,образуют сплошной монослой на каж­дой отдельной частице.

Основнымипреимуществами этого метода являются:

1)создание равномерных условий по всему объему сосуда, что дела

еще рефераты
Еще работы по биологии