Реферат: Механізми раннього ембріонального розвитку

--PAGE_BREAK--

4. Роль білкових ростових факторів у встановленні вагітності
4.1 Ростові фактори – регулятори ембріонального розвитку
При підготовці материнського організму до імплантації в якості локальних клітинних медіаторів дії стероїдів, які задіяні в циклічних змінах ендометрію, виступають ростові фактори. В доімплантаційний період вони присутні в ендометріальній тканині в дуже значних кількостях. Епідермальний фактор росту (ЕФР), інсуліноподібні фактори росту (ІФР-1 і 2), фактор росту фібробластів (ФРФ), фактори росту родини трансформуючих факторів росту (ТФР) активують мітотичну активність і властивість до диференціації клітин ендометрію, що підвищує сприйнятливість його до бластоцисти, яка імплантується під час “вікна імплантації”. Дією факторів росту опосередковуються специфічні зміни кількісного і якісного складу субпопуляцій лейкоцитів, які обумовлюють адекватну материнську імуносупресію та ендометріальну відповідь на занурення трофобласта.

Джерелом синтезу та секреції більшості ростових факторів і цитокінів є епітеліальні клітини, макрофаги та лімфоцити. Експериментально доведено, що синтез цитокінів нативними клітинами-кіллерами знаходиться під контролем прогестерону. Фактори росту і цитокіни являють собою декілька родин пептидів, які залучені у паракринні, інтракринні та аутокринні механізми регуляції клітинних реакцій за рахунок зв’язування із специфічними рецепторами клітинної поверхні [3], [23].

ссавець вагітність імплантація

4.2 Механізми дії ростових факторів
На відміну від ендокринних механізмів регуляції клітинної проліферації існують паракринні механізми, які діють на тканинному рівні. При цьому ростові фактори здійснюють дію головним чином на сусідні клітини.

Аутокринний тип регуляції – це коли клітини відповідають на дію фактору, який продукують самі і мають на нього рецептори. Цей тип регуляції має велике значення в період раннього ембріонального розвитку, коли йде активне розмноження ембріональних плюрипотентних клітин.

На відміну від стероїдних гормонів, які синтезуються з одного загального попередника, кожен поліпептидний фактор росту утворюється із свого попередника в результаті його процесінгу. Є дані, що ці попередники – трансмембранні білки, а активна форма фактору росту утворюється в результаті протеолітичного розщеплення зовнішньоклітинної ділянки молекули-попередника – тобто попередник є поліфункціональним пепетидом, а сама трансмембранна форма деяких факторів є рецептором для ліганду, що входить у його склад. Таким чином, є підстава вважати, що попередники деяких ростових факторів проявляють біологічну активність, залишаючись вбудованими в плазматичну мембрану клітин – у такому випадку вони взаємодіють із специфічними рецепторами сусідніх клітин без попереднього процесінгу. Такий спосіб регуляції клітинної проліферації називається юкстакринним. Є данні, що юкстакринна регуляція відіграє роль не тільки при міжклітинній адгезії, але і у ході стимуляції проліферації клітин. Особливо важливим це є в періоди раннього ембріонального розвитку, коли ще відсутні клітини, які секретують спеціальні гормони та ростові фактори [4], [8].

У послідовності взаємодії ростового фактора та клітини-мішені можна виділити певні послідовності:

·                    взаємодія фактору росту із специфічним рецептором плазматичної мембрани клітини-мішені;

·                    утворення і активація ліганд-рецепторного комплексу;

·                    біологічні ефекти, які виникають під дією регуляторних сигналів, індукованих фактором росту.


4.3 Взаємодія рецепторів факторів росту з лігандами
Рецептори факторів росту розташовані на поверхні зовнішньої мембрани клітин. Вони представлені численним класом глікопротеїдів з достатньо великою молекулярною вагою. Найбільш детально вивчено будову рецепторів інсуліну та епідермального фактор росту (ЕФР). Рецептор інсуліну складається з двох α- та двох β-субодиниць, які з’єднані між собою дисульфідними містками. Молекула рецептора складається із трьох основних функціонально різних доменів: ліганд-зв’язуючого, який багатий на вуглеводневі структури, трансмембранного, який складається переважно із залишків гідрофобних амінокислот, і цитоплазматичного, якій володіє ендогенною протеінкназною активністю. Цьому домену, який каталізує фосфорилювання білкових субстратів плазматичної мембрани і цитозолю по залишках тирозину, відводиться важлива роль у механізмах передачі регуляторного сигналу всередину клітин-мішеней. [12], [3]

Зв’язування рецептора з фактором росту забезпечує димеризацію і активацію тирозинкінази. Так ініціюється каскад реакцій фосфорилювання. Субстратами фосфорилювання є різні кінази, фосфоліпази і самі рецептори факторів росту. В якості біологічних ефектів фосфорилювання відбувається зміна мітогенних характеристик тканин, і диференціювання клітин, стимуляція транспортних систем і активація метаболічних шляхів.

Після взаємодії фактора росту з рецепторами клітинної поверхні відбувається процес кластеризації ліганд-рецепторних комплексів – процес їх агрегації у визначених місцях клітинної поверхні. Це необхідно для подальшого проникнення комплексів всередину клітин-мішеней. Після взаємодії інтенсивність зв’язування лігандів на поверхні клітин значно знижується – частина ліганд-рецепторних комплексів інтерналізується (піддається розщепленню в лізосомах), а частина повертається на поверхню клітин. Також виявлено, що після впливу деяких факторів росту на клітини у останніх змінюється здатність до зв’язування інших факторів росту.

Утворення комплексів факторів росту з рецепторами призводить до значних змін останніх. На відміну від рецепторів стероїдних гормонів, рівень мРНК рецепторів факторів росту багатократно збільшується протягом декількох годин після впливу. [2], [3].
4.4 Фактори росту на різних стадіях ембріонального розвитку
Всі періоди розвитку ембріонів співпадають у часі з перебудовою їх білкового складу. Перехід з однієї стадії в іншу пов’язують з регуляторним впливом специфічних білків, які діють на клітини локально по аутокринному або паракринному механізму. Під час аутокринної регуляції клітини, які секретують ростовий фактор, є одночасно і мішенями його дії, а під час паракринної регуляції фактори росту діють на сусідні клітини — мишені. За допомогою цих механізмів поліпептидні фактори росту виконують регуляторну роль в ембріональному періоді розвитку тварин.

Паракринні механізми регуляції клітинної проліферації, що діють на тканинному рівні, є еволюційно більш давніми ніж ендокринні. За цих умов фактори росту діють на клітини зблизька. Вони секретуються у позаклітинний простір, де можуть зв’язуватися зі специфічними рецепторами, що знаходяться на інших клітинах і які синтезують цей фактор росту [3].

Довгий час лишалося невідомим чи є аутокринна регуляція проліферації клітин феноменом, що характерний тільки для клітинної трансформації, чи це є загальнобіологічний механізм, за допомогою якого регулюються процеси клітинного розмноження. Згодом дослідженнями на ембріональних клітинах ссавців було доведено, що аутокринна регуляція проліферації має важливе значення під час ранніх періодів розвитку, коли відбувається активний поділ первинних ембріональних клітин [2].

Вже на початку доімплантаційного періоду ряд факторів росту починає проявляти ембріотрофічну активність. Наявність ТФР-α і внутрішньоклітинного домену до рецептора ЕФР вже виявляється у 4-клітиного ембріона. У 8- та 14-клітинних ембріонів виявляються ТФР- α, внутрішньо- та зовнішньоклітинні домени до рецепторів ЕФР, ІФР-1 та його рецептор. ТФР-β виявляється у ембріонах вівці на 12-16-й день, тоді як в культурі ендометрію його взагалі не має. Припускають, що продукування ембріоном ТФР-β розпочинається після материнського “впізнання” вагітності і співпадає по часу з імплантацією. Доведено, що родина ТФР-β відіграє важливу роль в цих процесах, адже саме вони забезпечує рецептивність ендометрію у відношенні бластоцисти. Децидуальний ТФР-β материнського походження може пригнічувати надлишкову інвазію трофобласта, а введення антагоністів ТФР-β викликало повне інгібування імплантації бластоцисти.

В останні роки багато уваги приділяється вивченню юкстакринної регуляції через ТФР-α в клітинах людського ендометрію при імплантації. Показано, що трансмембранна форма ТФР-α епітелію матки впливала на рецептор ЕФР мишиної бластоцисти при прямому міжклітинному контакті. Індукція та пік синтезу ТФР-α у мембранах епітелію матки співпадали по часу з періодом імплантації та були пов’язані з відповідним зростанням експресії рецепторів ЕФР на бластоцисті. При зв’язуванні ТФР-α з рецептором ЕФР розвивається два види відповіді: мітогенна і активація внутрішньоклітинних сигнальних шляхів. Така двостороння дія має дуже важливе значення у репродукції – при експресії ембріоном рецепторів ЕФР, які можуть взаємодіяти з ТФР-α ендометрію материнського організму, з одного боку стимулюється ріст і диференціювання ембріона, а з іншого – активується мітогенний сигнал у самих клітинах ендометрію, де відбувається інвазія. [10], [8].

Ранні доімплантаційні ембріони мишок і корів мають рецептори різних ростових факторів серед яких трансформуючий ростовий фактор TGF-α і TGF-β та інсуліноподібний ростовий фактор IGF-І, що в більшості випадків починають проявлятися на стадії незаплідненої яйцеклітини [19]. Доведено, що епідермальний ростовий фактор (EGF) здатний стимулювати ембріональний розвиток мишачих ембріонів у культурі. Інсулін стимулював синтез білків у 8-ми клітинних ембріонах мишок, бластоцистах і експандованих бластоцистах, специфічно впливав на диференціацію, оскільки він стимулював клітинне дроблення тільки внутрішньої клітинної маси, в той час як трофоектодермальні клітини лишалися „байдужими” до цього впливу [15]. Вплив інсуліну на ембріональний розвиток був очевидним навіть до 8-бластомерної стадії, коли виявляли тільки м-РНК інсулінового рецептору і не було виявлено будь-яких білків [21].

Рецептори IGF-1 було виявлено в ранньому ембріональному розвитку і доведено, що IGF-1 активує стимуляцію ембріонального метаболізму починаючи з 2-клітинної стадії розвитку. Попередніми дослідженнями на ембріонах свиней [8] виявлено вплив інсуліну на біосинтез естрадіолу, що дуже важливо для маткових шляхів, стимулює ембріональний диск до синтезу чотирьох нових білків, які потім беруть участь у механізмі материнського розпізнавання вагітності [24]. В цьому контексті ідентифікація IGF-І та IGF-IIу рідині яйцепроводів свині разом з присутністю у епітелії яйцепроводів корів IGF-ІІ транскрипцій дозволило припустити, що білки, які пов’язані з інсуліном, є медіаторами впливу яйцепроводів на ембріональний розвиток. Відмічають, що яйцепроводи овець і корів секретують білки, які посилюють дію інсуліну в стимуляції мітозів ембріонального трофобласту [24].

Паралельні дослідження довели присутність м-РНК TGF-αта TGF-β, епідермального фактора росту, фактора росту тромбоцитів PDGFта інших ростових факторів у яйцепроводах ссавців [3]. Фактори росту PDGF, активін та епідермальний ростовий фактор ідентифіковано серед білків, які секретуються і локалізуються в окремих ділянках протоків яйцепроводів [25].

Зустрічається застереження щодо дії високих концентрацій ростових факторів у середовищі, які пригнічують проліферацію клітин яйцепроводів та кумулюсу [22].

Експерименти ряду авторів з вивчення впливу факторів росту на розвиток і дроблення ранніх ембріонів тварин доводять позитивний ефект цих поліпептидів при культивуванні цих ембріонів invitroна фідерних моношарах. Y. Tsuchiyaetal. підтвердили суттєвий вплив EGFв кількості 10нг/мл, інсуліну- 20мкг/мл не тільки на розвиток invitroбластоцист овець, але й змогли отримати з їх внутрішньої клітинної маси колонію стовбурових ембріональних клітин, які були життєздатними на протязі 8 тижнів. Цікаво, що інсулін більш сприятливо впливав на формування ЕСК-колоній. Створені колонії клітин росли добре, але після першого пасажу зменшили інтенсивність росту, зберігаючи свою морфологію. Додавання EGFу середовище також спричинило ріст деяких колоній, але колонії були маленькі і росли слабо. Після двох пасажів вони також зберігали свою морфологію.

За даними Y. Iwakuraetalприсутність лейкеміє інгибуючого ростового фактору (LIF) та EGFв кількості 10 нг/мл сприяло суттєвому збільшенню колонії стовбуроподібних (плюріпотентних) клітин при культивуванні їх на фідерному моношарі ембріонального фібробласта протягом 5 днів. Подібні результати були раніше отримані на вівцях із застосуванням двох типів фідерних шарів: стовбурових клітин, що сформовані плюріпотентними клітинами бластоцист мишок і ембріональним фібробластом, які одержали з плодів вівцематок 32-го дня вагітності [17].

Glister C. atelв експерименті спостерігали invitroдозрівання і запліднення 1761 ооцитів, дійшли висновку, що додавання ростових факторів, таких як IGF-1, TGF-a, EGFта PDGFв кількості 10 нг/мл до культурального середовища, однак, сприяє швидкості дроблення ембріонів, розвитку до стадії бластоцисти і вилуплення бластоцист з прозорої оболонки в присутності сироватки. [15]
4.5 Ростові фактори під час децидуалізації
Клітини строми у ссавців піддаються децидуальній трансформації безпосередньо перед імплантацією під впливом метаболічного сигналу з сторони бластоцисти. Перед реакцією приєднання бластоцисти до ендометрію спостерігається підвищений рівень експрессії ЕФР. Децидуальна трансформація локалізується спочатку безпосередньо біля бластоцисти, потім метаболічний сигнал епітелію передається стромі, що активує відповідну стромальну децидуальну реакцію.

Сама децидуалізація включає у себе багаточисельні зміни у стромальних клітинах. Спочатку збільшується проліферація мезенхімальних клітин, які піддаються постмітотичній диференціації і, таким чином, формують первинну децидуальну зону. Потім проліферують і диференціюються розташовані далі мезенхімальні клітини, в результаті чого утворюється вторинна децидуальна зона. Її клітини далі диференціюються і піддаються апоптозу, звільняючи таким чином місце для ембріона [10].

Серед різноманітних факторів росту, які експресуються у децидуальних клітинах у цей період – ІФР-1, рецептори до ЕФР, ТФР-α та гепарин-зв’язаного ЕФР. Наприклад, при введенні геперин-зв’яаного ЕФР у поживне середовище invitroвикликало локальну реакцію клітин ендометрію, яка полягала у підвищенні проникності судин та підсиленні процесів децидуалізації. [24]. Також є дуже важливим факт міжклітинної взаємодії між клітинами строми і ендометрію, які реалізуються сигнальними молекулами гістаміну та простагландинами. Збільшення продукції простагландину E2 модулює секрецію активатора плазміногена урокіназного типу, який експресується у стромальних клітинах ендометрію. Акумуляція активатора плазміногена і наступна судинна реакція знаходиться під контролем ЕФР. Цей ефект може інгібуватись інгібіторами транскрипції або трансляції. Ефекторні молекули родин ЕФР, інтерлейкін-1 і трансформуючі фактори росту -α та -β виявляються у гризунів на ранніх стадіях імплантації. Показано, що ген ЕФР експресується у просвіті матки миші, де знаходяться бластоцисти безпосередньо перед імплантацією. ЕФР сприяє росту бластоцисти і розростанню трофобластів invitro. Такий же ефект спостерігається у стромальних клітинах ендометрію людини [25], [26].

Виявлена висока активність ЕФР у клітинах залозистого епітелію матки, тоді як у стромі та міометрію його рівень був набагато нижче. У свиней на 2-4-й день вагітності ЕФР виявлявся переважно в епітелії матки. На 5-й день його експресія в епітелії знижувалась, але на 6-7-й день виявлялась вже в децидуальних клітинах. Крім того, цей фактор був виявлений у трофоектодермі і у внутрішній клітинній масі доімплантаційного ембріона на 4-5-й день чи в ембріональній ендодермі та мезодермі на 5-6-й день вагітності. Передбачається, що ЕФР відіграє важливу роль у рості, міграції та адгезії клітин ендометрію, а також у формуванні міжклітинного матриксу протягом статевого циклу і на ранніх стадіях розвитку ембріона. Також рецептори ЕФР були виявлені у плаценті, що демонструє участь родини ЕФР у підтриманні вагітності. [8]

В ембріонах на ранніх стадіях розвитку продемонстровано присутність всієї родини інтерлейкінів, яка включає в себе декілька гомологічних поліпептидів та їх рецепторів. В організмі жінок поліпептиди родини ІЛ-1 були присутні у макрофагах та ендотеліальних клітинах, переважно в секреторній фазі статевого циклу[10].На ранніх стадіях вагітност взаємодія ембріонального ІЛ-1 та рецепторів ІЛ-1 в ендометрії може забезпечувати впізнання та імплантацію ембріона. [1], [2].

ІЛ-1 та ТФР-β відіграють суттєву роль в імплантаційних процесах за рахунок регуляції експресії стромою ендометрію тканинних інгібіторів металлопротеїназ –1 та –3, а також колагенази IVтипу, які є дуже важливі при інвазії трофобласта. Зниження синтезу колагена IVтипу в стромі матки починається в середині секреторної фази і продовжується після імплантації. Рахується, що зменшення в’язкості цього типу колагену – головний фактор, який сприяє розвитку набряку у зовнішньоклітинному просторі при імплантації бластоцисти. Прогестерон інгібував стимулюючий ефект ІЛ-1 у відношенні металопротеїнази-3 у секреторній фазі invivoта invitro. Відомо, що подавлення активності металопротеїназ є необхідним для зберігання стабільності тканин при інвазійних процесах при імплантації та розвитку плаценти. ЕФР та ФРФ, навпаки, підвищували рівень протеолітичних ферментів, які продукуються ендометріальними стромальними клітинами у процесі децидуалізації invitro, але не впливали на активність їх інгібіторів. [9]
4.6 Ростові фактори під час імплантації
Основну роль у проліферації клітинних компонентів залозистого епітелію ендометрію, строми, гладеньких м’язів та ендотелію судин відіграють специфічно експресовані під час проліферативної фази циклу ЕФР, ІФР-1 та ІФР-2, ФРФ.

Вважається, що інсуліноподібні фактори росту стимулюють мітоз і диференціацію клітин ендометрію протягом статевого циклу і на ранній стадії вагітності, є мітогенними для клітин строми та залозистого епітелію. ІФР-1 індукує багаточисельні локальні відповіді у клітинах ендометрію – такі, як підвищення локальної проникності судин, децидуалізацію та експресію деяких генів. Під час імплантації на стадії інвазії трофобласта ІФР-1 та ІФР-2 виявляють різні по локалізації та часовим характеристикам профілі експресії. Так, ІФР-1 експресувався у стромі та залозистому епітелії – тобто на ділянках, які є початковими на етапах прикріплення та інвазії трофобласта. Велика кількість ІФР-2 була виявлена в частині апікальних клітин, тоді як у базальному шарі на латеральних плазматичних мембранах більше виявляється ІФР-1. Це свідчить про вирішальну роль ІФР-2 у процесах саме адгезії. Тварини, у яких порушений ген ІФР-1, проявляли знижену фертильність. В різних групах клітин трофобласту виявляється знижений рівень ІФР-1 і навпаки, підвищений рівень ІФР-2. [10]

При вивченні родини ІФР-зв’язуючих білків встановлено, експресія ІФРСБ-1 знаходиться під контролем прогестерону, а сам ІФРСБ-1 виступає в ролі білка, який захищає материнський організм від надлишкової інвазії трофобласта і вже на 7-10-й день циклу ці білкі виявляються в децидуальних клітинах на ділянці імплантації… [19]

Неопосередкована дія 17-β-естрадіолу на проліферацію епітеліальних клітин ендометрію проявляється у впливі естрадіолу на секрецію ІФР-1 стромальними клітинами ендометрію. Одночасно виявлені стимулюючі ефекти інсуліну на проліферацію клітин ендометрію, які здійснюються через активацію стромальних клітин. [11], [27].


5. Список літератури

1.                 Гьюдай Линда С. Имплантирующаяся оплодотворённая яйцеклетка и материнский организм // Проблемы эндокринологии, 1999; Т.5. С.30-32

2.                 Чернуха Г.Е., Сметник В.П., Роль факторов роста в функции репродуктивной системы // Проблемы эндокринологии, 1996, Т.2. С.8-13

3.                 Фильченков А.А., Стойка Р.С., Быкорез А.И. Трансформирующие факторы роста, 1994, 291 С.

4.                 MonniauxD., MongetP., BesnardN. Growthfactorsandantralfolliculardevelopmentindomesticruminants. // Theriogenology.-1997.Vol.47. №1.P. 3-12

5.                 Abigail L. Fowden. Endocrine regulation of fetal growth // Reproduction. Fertility. Development // 1995. Vol.7. P.351-363

6.                 Aplin J.D. Adhesion molecules in implantation // Reviewes of reproduction. 1997. Vol.2. P.84-93

7.                 Bass K., Morrish D., Roth I. Human cytotrophoblast invasion is up-regulated by EGF:evidence that paracrine factors modify this process // Developmental biology.- 1994.- Vol.164.№2.- P.550-556

8.                 Buyalos R.P., Cai X. Preimplantation embryo development enhanced by Epidermal Growth Factor // Journal of Assisted Reproduction and Genetic.-1994. Vol.11. №1. P.33-37

9.                 Carson D.D., Bangchi I., Dey S.K. Embryo implantation // Developmental biology. 2000. Vol.223. P.217-237

10.             Carver J., Martin K., Spyropoulou I. An in vitro model for stromal invasion during implantation of the human blastocyst // Human reproduction. 2005. Vol.18. P.283-290

11.             Davis J.S., May J.V., Keel B.A. Mechanisms of hormone and growth factors action in the bovine corpus luteum //Theriogenology.- 1996.- Vol. 45,№ 7.- Р.1351-1380

12.             Derrar N., Price C.A., Sirard M.A., Effect of growth factors and co-culture with ovarian medulla on the activation of primordial follicles in explants of bovine ovarian cortex // Theriogenology. 2000. Vol.54. №4. P.587-598

13.                 продолжение
--PAGE_BREAK--