Реферат: Культивирование бактерий

<span Monotype Corsiva";mso-fareast-font-family:Batang;mso-bidi-font-weight:bold; mso-bidi-font-style:italic">ГОУВПО “Марийский государственный университет”

<span Monotype Corsiva";mso-fareast-font-family:Batang;mso-bidi-font-weight:bold; mso-bidi-font-style:italic">Кафедра биохимии и молекулярной биологии

Культивирование бактерий.

курсоваяработа

Выполнил:

студентIIIкурса Марийского государственного  университета

биолого-химического факультета, очного отделения «Биоэкология»

Гайдай Роман Андреевич.

Руководитель:

Гажеева Тамара Петровна.

Йошкар-Ола, 2007г.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«Times New Roman»; mso-ansi-language:RU;mso-fareast-language:RU;mso-bidi-language:AR-SA">

Содержание.

1.Основы жизнедеятельностимикробных клеток---------------       3стр.

1.1Внутриклеточный рН.---------------------------------------------       3 стр.

1.2Диапазон рН.--------------------------------------------------------       3 стр.

1.3Природные среды. —        3стр.

1.4Регуляция рН среды. —        3стр.

1.5Влияние рН на микробные клетки. —        4стр.

2.Микробный рост. —       4стр.

2.1.Температурный    диапазон.-------------------------------------      4 стр.

2.2.Микробныйрост существенно зависит

от присутствиякислорода и других газов------------------------        5 стр.

2.3Растворимостьгазов.----------------------------------------------        5 стр.

2.4.Аэрация. ------------------------------------------------------------        5 стр.

2.5.Контроль за концентрацией О2 -------------------------------         5стр.

2.6.СО2.-----------------------------------------------------------------          6 стр.

2.7.Активность воды и осмотическое давление зависят от концентрациирастворенных осмотически активных частиц.--      7 стр.

2.8. Давление иудаление кислорода, влияние на бактериальную клетку.-----------------------------------------------------------------------   8 стр.

3.0.Свет может служить источником энергии

 для микроорганизмов.--------------------------------------------------    9стр.

3.1.Среды для выращивания бактерий.------------------------------     9 стр.

3.2.Источники энергии.-------------------------------------------------    10 стр.

3.3.Основными питательными элементами служат углерод, азот, сера ифосфор.-------------------------------------------------------------------   10 стр.

3.4.Длявыращивания чистых культур микроорганизмов необходима стерилизация сред иинструментов. ----------------------------------   14 стр.

3.5.Рост можноизмерять различными методами.------------------ 16 стр.

3.6.Подсчет колоний. ----------------------------------------------------   18 стр.

3.7.Метод определения наиболее вероятного числа бактерий.-   19 стр.

4.0. Методы хранения культур обеспечивают

длительное поддержание их жизнеспособности.-------------------  20 стр.

4.1.Работа микробиологов основана на методах

элективного культивирования и получения чистых культур.----  21стр.

4.2. Полунепрерывное культивирование.----------------------------   23 стр.

4.3.Методы консервирования основаны на подавлении микробного роста.--------------------------------------------------------------------------24 стр.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«Times New Roman»; mso-ansi-language:RU;mso-fareast-language:RU;mso-bidi-language:AR-SA">

1.Основы жизнедеятельности микробных клеток.

1.1Внутриклеточный рН.

Большинство видов бактерий,способно расти в широком диапазоне рН (~ 4 ед.), но их быстрый рост наблюдаетсяв более узком диапазоне примерно 2 ед. рН. При этом значение рН поддерживается,на постоянном, оптимальном уровне, который часто сильно отличается от рН среды.Регуляция внутриклеточного рН опосредована неизвестной пока сенсорной системой,и протонодвижущей силой.

Если рН среды, болеещелочной, чем рН цитоплазмы, клетки бактерий, должны поглощать Н+ сиспользованием энергии мембранного потенциала.

1.2Диапазон рН.

Бактерии, для которыхоптимальны значения рН, близкие к 7,0, например Е.соli, составляютгруппу нейтрофилов. Экстремофильныевиды, приспособленные к очень низким значениям рН, называют ацидофилами. К ним относится,например, бактерия Thiobacillus ferroxidons, растущая при рН 2,0-8,0. Виды — алкалифилы растут в щелочныхсредах; например, для Bacillus alcaliphilusоптимальное значение рН составляетпримерно 10,5. Внутри-клеточный рН у этих трех приведенных в качестве примеровбактерий равен примерно 7,6; 6,5 и 9 соответственно. Некоторые бактерии, такиекак Acetobacterи Lactobacillus, способны сохранять жизнеспособность при экстремальных значениях рНв течение определенного времени. Большинство грибов предпочитает слабокислуюсреду.

1.3Природныесреды.

Спектр значенийрН в природных местообитаниях представлен на рис. 6.2. Алкалифилы способнывыживать при рН > 10, но рост их возможен, как правило, при рН < 10.Многие бактерии при росте потребляют и/или образуют кислоты либо основания. Например,при использовании NH4CLв качестве источника азота клеткиассимилируют NНз,выделяя в среду НСL.

1.4РегуляциярН среды.

Для контроля заизменением рН среды при росте бактерий (например, как диагностическимпризнаком) в состав многих питательных сред вводят индикаторы рН (слабыеорганические кислоты или основания, яркоокрашенные в зависимости отпротонирования / депротонирования). В качестве таких индикаторов используютбромфеноловый синий (рКа 4,0), метиловый красный (рКа5,2) и тимоловый синий (рКа 8,9), в кислой форме приобретающиежелтую окраску. Поддерживать значение рН среды в узком диапазоне позволяютавтоматические системы контроля рН, состоящие из рН-электрода, рН-метра,системы регуляции/установки допустимых пределов изменения рН и насоса для добавлениякислоты или основания.

1.5Влияние рНна микробные клетки.

 Неблагоприятная концентрация Н+ иОН~ в среде влияет на различные структурные и биохимические параметры микробныхклеток, Цитоплазма хорошо забуферена; при ее буферной емкости для изменения рНна 1 ед. необходимо > 0,1 моль кислоты или щелочи. Изменение рН среды, впервую очередь влияет на клеточные покровы; диссоциация/протонирование входящихв их состав макромолекул, таких как липополисахариды, белки поверхностного слояи компоненты плазматической мембраны, приводят к изменениям в локальномраспределении заряда, и вследствие этого к нарушениям в делении, морфологии,адгезии и флокуляции клеток или к разрушению плазматической мембраны. Крометого, сдвиги рН среды влияют на метаболизм. В промышленных технологиях путем изменениярН срёды вызывают остановку роста культуры и выделение того или иного продукта(трофофаза —> идиофаза). Когда в результате брожёния рН снижается до определенногокритического уровня, в качестве конечного продукта начинает образовыватьсяспирт, а не кислота + Н^. От рН среды зависит токсичность многих соединений.Слабые кислоты, такие как уксусная, пропионовая, сорбиновая (для всех трех рКа= 4,7) и бензойная (рКа .=,3,7), способны проникать через мембрану впротонированной форме [АН] путем пассивной диффузии. В цитоплазме они диссоциируютс образованием аниона [А~], не способного проникать через мембрану, и Н+(«ионная ловушка»), что приводит к снижению внутриклеточного рН. Ингибирующее действиеэти кислоты оказывают лишь в том случае, если значение рН среды достаточнонизкое, т. е. сравнимо с величиной их рК. Поскольку эти кислоты не токсичны длячеловека, их широко используют как консерванты в производстве пищевыхпродуктов.

2.Микробныйрост.

2.1.Температурный    диапазон.

Микробный рост. возможен в широком диапазоне температуры с пределами ниже0 и выше 100 °С.

Для   большинства прокариот интервал температур, вкотором возможен рост, составляет примерно 40 °С; с высокой скоростью ростпроисходит в более узком интервале — примерно 20 °С (рис. 6.3). Минимальная,максимальная и оптимальная температуры (основные температурные точки) значительноварьируют среди прокариот. По отношению к температуре их условно делят нагруппы: мезофилы, термофилы и психрофилы. У мезофилов, к которымотносится большая часть бактерий, оптимальная для роста темпера тура лежит винтервале между 20 и 42 °С. Среди этих организмов имеются термотолерантныевиды, способные выживать при температуре 50 *С. Большинствотермофильных видов растет при температуре до 70 °С. Таких значений онадостигает, например, в гниющем компосте и на гретом солнцем поверхностном слоепочвы. У отдельных термофильных организмов, называемых экстремальными  термофилами или гипертермофилами, температурныйоптимум.превышает  70 °С;  например,  Sulfolobus  acidocaldarius растет при 80 °С,  Purrodictumoccultum—  при 105 °С. В природе такие значениятемпературь встречаются только в зонах вулканической активности. Оптимальнаятемпература для роста психрофильных бактерий не превышает 20 °С. ое обитают в морской воде с температуройоколо 5 °С, и в полярных областях земного шара. Некоторые бактерии хорошорастут при температуре —10 °С, в микроскопических водных «карманах на границераздела между льдом и морской водой в этих условиях рост, по-видимому, лимитированнедостатком жидкой воды. При кратковременном нагревании до комнатной температурыпсихрофильные организмы погибают. В противоположность этому большинствомезофилов характеризуется психротолерантностью.

Быстрое изменениетемпературы среды от нормальной до экстремальной, например резкое охлаждение до4 °С или нагревание до 54 °С, может вызвать повреждение клеток.Чувствительность к нагреванию зависит от влажности среды, а также отфизиологического состояния культуры (в стационарной фазе роста клетки менеечувствительны, чем в фазе активного роста). От физиологического состояниякультуры зависит и реакция клеток на быстрое охлаждение.

2.2.Микробный рост существенно зависит

от присутствия кислорода и других газов

Облигатноаэробные бактерии нуждаются для роста в молекулярном кислороде; дляфакультативных анаэробов предпочтительны аэробные условия, но они способнырасти и в отсутствие О2 — Многие бактерии относятся к микроаэрофилам, т. е.приспособлены к росту при очень низком содержании кислорода в среде (например,0,1-0,5%), типичном для природных местообитаний. Такие бактерии часто неудается культивировать в обычных лабораторных условиях; иногда их рост можнополучить в виде тонких бактериальных пленок на поверхности плавающих частиц,где они понижают концентрацию кислорода благодаря дыхательной активности.

2.3Растворимость газов.

Кислород служитконечным акцептором электронов (в случае аэробных бактерий). Другие газы могутиспользоваться иным образом, например Н^, СН^ и СО, как доноры электронов и/илиисточники углерода, N2 —как источник азота, Н^З — как восстановитель, удаляющийкислород из среды, донор электронов и источник серы, СО^ — как дополнительныйили единственный источник углерода. Кислород, подобно другим газам,относительно слабо растворим в воде (см. разд. 30.1.3). Растворимость любогогаза прямо пропорциональна его парциальному давлению и снижается с увеличениемтемпературы и осмотического давления.

2.4.Аэрация.

При большойплотности клеток в культуре аэробным бактериям необходима усиленная аэрация.Достаточное снабжение клеток кислородом можно обеспечить различными способами,позволяющими повысить скорость его массопереноса и увеличить площадьповерхности раздела газ/жидкость. С целью обеспечения доступа кислорода сосудыдля культивирования

бактерийзакрывают пробками из пористого материала, чаще всего ваты. Для культивированияаэробных микроорганизмов имеются специальные плоскодонные колбы (Эрленмейераили Фернбаха) и колбы с отбойниками, в которые среду наливают небольшим слоем;для большей эффективности газообмена эти колбы помещают на качалку. Привыращивании культур в объеме среды более <st1:metricconverter ProductID=«0,5 л» w:st=«on»>0,5 л</st1:metricconverter> используют ферментеры, снабженныемешалкой и системой продувания воздуха или кислорода. Все эти способыкультивирования помогают добиться того, чтобы как можно больше мельчайшихпузырьков воздуха подолгу находилось в среде, обеспечивая эффективноепоступление О2 из газообразной фазы в жидкую. В некоторых случаях припродувании газа требуется принимать меры против избыточного пенообразования.

2.5.Контрольза концентрацией О2.

Количестворастворенного кислорода в среде поддерживают на постоянном уровне, регулируяскорость потока газа, процентное содержание кислорода в газовой смеси искорость перемешивания (концентрацию О^ определяют при помощи кислородногоэлектрода; см. рис. 11.1). Эффективность подачи О2 в ферментер рассчитывают какскорость абсорбции кислорода, выражая ее в ммоль О2, поступающих в <st1:metricconverter ProductID=«1 л» w:st=«on»>1 л</st1:metricconverter> не содержащей кислородсреды за 1 мин. В условиях хорошей аэрации находятся бактерии, растущие в видетонкой пленки на поверхности среды. Однако в бактериальных пленках или колонияхна поверхности агара поглощение кислорода клетками обычно прёвышает егопоступление путем диффузии, что приводит к образованию бескислородной зонывнутри колонии и под нею в агаре. Подобный градиент О2 характерен также длябиопленок и донных осадков; метаболизм многих бактерий переключается в этихусловиях на брожение или анаэробное дыхание.

2.6.СО2.

Прикультивировании автотрофных бактерий, для которых диоксид углерода служитединственным источником углерода, его во многих случаях вносит в среду в виде NaНСОз — Необходимо учитывать, чтоконцентрации растворенных СО^ и НСО^" и, следовательно, распределениеуглекислоты между жидкой и газовой фазами зависит от рН среды (см. разд.6.2.1). Диоксид углерода необходим также гетеротрофным бактериям, так как он участвуетв биосинтетических реакциях карбоксилирования. Многие патогенные и

симбиотическиебактерии адаптированы к высокому парциальному давлению СО2 в организме-хозяинеи часто могут расти только при высокой концентрации (примерно 10%) СО2 вгазовой фазе. Тщательное удаление СО2 из среды с помощью щелочной ловушкиприводит к остановке роста большинства бактерий.

2.7.Активностьводы и осмотическое давление зависят от концентрации растворенных осмотическиактивных частиц.

Вода в живыхорганизмах не только выполняет роль растворителя, но также служит субстратоммногих ферментативных реакций, влияет на кон-формацию макромолекул, принимающихблагодаря гидратации необходимую структуру, и поддерживает клеточный тургор.Доступность воды зависит от ее содержания в среде обитания, т. е. от уровнявлажности, например почвы или хлеба, либо, в водных средах, от концентрациирастворенных веществ — ионы (Nа+, С1- и др.), сахара и другие соединения конкурируютза молекулы воды и «связывают» их, переводя в недоступную для Организма форму.В этом смысле условия высокого содержания в жидкой среде соли или сахарааналогичны условиям сухости, но в целом влияние тех и других условий, как имеханизмы адаптации к ним, различны. Тем не менее при обоих типах «сухости»диффузия воды происходит из области ее высокой концентрации (влажная областьили низкая концентрация растворенных веществ) в область низкой концентрации(сухая область или высокая концентрация растворенных веществ). Доступностьвлаги для микроорганизмов оценивают с помощью такого показателя, как активностьводы (ав) в среде, представляющего собой отношение давления водяногопара в исследуемой системе (растворе или твердой среде) к давлению пара надчистой водой. В среде, содержащей растворенные вещества, осмотическое давление(Р) и ав связаны следующим соотношением:

<img src="/cache/referats/26797/image002.gif" v:shapes="_x0000_i1025"><img src="/cache/referats/26797/image002.gif" v:shapes="_x0000_i1026">

                                                   P= <img src="/cache/referats/26797/image004.gif" v:shapes="_x0000_i1027">

где R— газовая постоянная, Т — абсолютнаятемпература и УЕ — объем 1 моль воды. В идеальном случаеосмотическое давление раствора, содержащего 1 моль осмотически активных частиц(например, ионов Nа+или С1- либо молекул глюкозы), составляет 22 бар (2,2 МПа). Эта величинасоответствует давлению газа при его концентрации 1 моль/л. Величины авдля некоторых природных местообитаний приведены на рис. 6.2.

В соответствии сразличиями между условиями «сухости» варьируют и молекулярные механизмыадаптации к ним микробов. Наиболее распространенная на Земле природная среда—это морская вода; она содержит примерно 3% КаС1, а также небольшое количестводругих неорганических веществ. Большинство морских микроорганизмов нуждается вповышенной концентрации Nа+, и поэтому они названы галофилами. Некоторыебактерии способны расти в средах с высоким содержанием соли, но не нуждаются вней — это галотолерантные организмы. Степень галофилии варьирует убактерий от низкой (1-6%) и средней (6-15%) до экстремальной (15-30%). Принизкой активности воды, как правило, микроорганизмы не выживают, и благодаряэтому засолка, сушка или добавление сахара предохраняет пищевые продукты отпорчи. Для большей части бактерий предпочтительны значения, ав 0,98-0,99.Организмы, растущие в средах с высоким содержанием сахара, называют осмофилами;растущие в очень сухих (из-за отсутствия воды) средах — ксерофилами. Привыращивании морских бактерий высокое осмотическое давление среды обычно создаютдобавлением солей (NаС1,КС1, Nа2SО4; искусственная морская вода).Необходимо учитывать, однако, что многие ионы в повышенных концентрациях могутоказывать вредное воздействие.

2.8.Давлениене оказывает

существенноговлияния на рост бактерий

При изучениивлияния гидростатического давления на рост бактерий были получены неожиданныерезультаты: оказалось, что изменение давления в диапазоне 0-100 бар (0-10 МПа)не оказывает никакого эффекта на рост большинства бактерий или же его влияниенезначительно. Тем не менее барофильные бактерии, обитающие в морскихглубинах, не только адаптированы к высокому давлению, характерному для этихместообитаний, но и нуждаются в нем (например, в давлении 600 бар на6000-метровой глубине). Для изучения глубоводных микроорганизмов требуетсясложное оборудование, позволяющее поддерживать высокое давление.

Природныеместообитания.

 Многие природные среды содержат растворенныйкислород в незначительном количестве, не содержат кислорода вообще илистановятся анаэробными на определенные промежутки времени. Анаэробные условиявозникают в случае, если О2 потребляется микроорганизмами и при этом диффузияего ограничена. Кроме того, концентрация молекулярного кислорода может падать врезультате его восстановления характерными для анаэробов конечными продуктамиметаболизма, такими как Н2S.

Анаэробы.

 Микроорганизмы, способные расти как вприсутствии, так и в отсутствие кислорода, называют факультативнымианаэробами. К микроаэрофилам относят те организмы, которые нуждаются вкислороде для дыхания, но растут только при низком содержании его в среде. Анаэробыне способны осуществлять дыхание с участием О2; одни из них могут расти вприсутствии кислорода и устойчивы к нему (аэротолерантные бактерии), другиеже — облигатные (строгие) анаэробы — погибают при контакте с О2или по крайней мере растут в его присутствии очень слабо. Метаболизм облигатноанаэробных бактерий приспособлен к средам с низким значениемокислительно-восстановительного потенциала, и некоторые их ферментычувствительны к кислороду. Таким образом, рост строгих анаэробов возможентолько в отсутствие кислорода и при восстановительных условиях[окислителыю-восстановительный потенциал среды (Е0) должен бытьотрицательной величиной].

Удалениекислорода.

Для уменьшениясодержания кислорода в среде ее вначале кипятят. Оставшийся О2 удаляютпропусканием через среду газа, например очищенного от кислорода N2 или смёси N2/СО2. После этого в среду добавляютвосстановитель и сосуд герметически закрывают. Восстановитель поддерживаетокислительно-восстановительный потенциал среды, аналогично тому, как буферрегулирует ее рН. В качестве восстановителей для этого используют Nа2S, FеS, дитионит, органические тиоловые соединения, такие кактиогликолат и цистеин, или цитрат титана (Ш). Величина Е'0этихсоединений варьирует приблизительно от —0,2 В (цистеин) до —0,5 В [Т1(Ш)]. Поддействием восстановителя О2 восстанавливается до Н2О, и таким образомвосстановитель функционирует как окислительно-восстановительный буфер. Следыкислорода из газов удаляют путем абсорбции или добавления к газу Н2(~5%), который при участии катализатора (палладий) реагирует с О2, в результатечего образуется вода. Значение окислительно-восстановительного потенциала средыудобно контролировать, добавляя в среду следовое количество нетоксичного,окрашенного в окисленном состоянии, самоокисляющегося красителя, которыйстановится бесцветным в восстановленной форме. Значение Е'0длянаиболее часто используемых красителей такого рода варьирует от 0 В(метиленовый синий, резазурин) до —0,25 В (феносафранин). Следовательно, еслирезазурин не окрашен при рН 7,0, значение Е' среды меньше 0 В, т. е. онаподходит для роста строгих анаэробов.

<span Arial",«sans-serif»; mso-bidi-font-family:«Times New Roman»;color:black">3.0.Свет

<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">может<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">служить<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">источником<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">энергии для<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">микроорганизмов<span Arial",«sans-serif»;color:black">, <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">но<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">одновременно оказывает<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">повреждающее<span Arial",«sans-serif»;color:black"> <span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family: «Times New Roman»;color:black">действие.<span Arial",«sans-serif»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»">

Фототрофныепрокариоты используютсвет того или иного участка спектра и определенной интенсивности в качествеисточника энергии. В то же время свет высокой интенсивности может оказыватьингибирующее действие и на фототрофные, и на нефототрофные микроорганизмы врезультате фотохимических реакций. У фототрофов защиту от повреждающегодействия света обеспечивают те же пигментные системы, которые участвуют вфотосинтезе; защитные пигментные системы обнаружены также у многих нефототрофныхорганизмов.

3.1.Средыдля выращивания бактерий содержат все необходимые питательные вещества.

Помимосоответствующих физико-химических условий среды, бактериям необходимы для ростаисточники энергии и всех элементов, из которых состоят компоненты клеток.«Узкоспециализированные» бактерии нуждаются в строго определенных питательныхвеществах, тогда как «малоспециализированные» способны использовать широкийнабор питательных веществ.

Бактерии-прототрофымогут расти на простыхсредах, содержащих одно вещество в качестве источника углерода и энергии, атакже несколько неорганических солей для обеспечения потребности в другихэлементах. В отличие от этого рост ауксотрофов зависит от присутствия всреде готовых клеточных компонентов — либо витаминов в следовых количествах вкачестве предшественников коферментов и простетических групп, либо (в большемколичестве) аминокислот или других органических соединений, входящих в составклеточных полимеров или представляющих собой важные растворимые вещества. Умногих микроорганизмов потребности в питательных веществах изучены поканедостаточно, и их удается культивировать лишь в средах, содержащих сложныеприродные компоненты, такие как сыворотка крови, жидкость рубца, дрожжевойавтолизат или пептоны. Некоторые облигатно паразитические или сим-биотические бактерии не способны, по-видимому, растивне живого организма-хозяина. Подобно этому некоторые анаэробные бактерии,сбраживающие «низкоэнергетические» субстраты, растут лишь в присутствиипартнера — синтрофного организма, который потребляет продукты броженияблагодаря функционированию специальных метаболических путей.

В наибольшемколичестве для роста необходимы источники энергии, электронов и углерода плюсакцепторы электронов.

3.2.Источники энергии.

Основнойисточник энергии на Земле — это солнечный свет; среди прокариот его способныиспользовать фототрофные бактерии, цианобактерии и некоторые археи. Микроорганизмы,не использующие свет, получают энергию для роста путем окисления илисбраживания химических веществ (хемотрофы). Для окисления, как правило,необходим О2 в качестве акцептора электронов, но многие бактерии способны канаэробному дыханию. Таким образом, для роста бактерий, осуществляющих дыхание,необходимо присутствие в среде кислорода или другого окислителя.

Донорыэлектронов.

 В качестве доноров электронов для дыхания ибиосинтеза литотрофные микроорганизмы используют неорганическиесоединения, органотрофные микроорганизмы — органические вещества.

Источникиуглерода.

 Для гетеротрофов источником клеточного углерода служат органическиесоединения. Автотрофы при наличии источников энергии и восстановителей используютв качестве единственного источника углерода СО2. Тем микроорганизмам, которыене обладают способностью использовать энергию света, требуется при этоморганический или неорганический субстрат в качестве донора электронов иисточника энергии. Бактерии, осуществляющие дыхание, нуждаются, кроме того, в акцептореэлектронов.

3.3.Основнымипитательными элементами служат углерод, азот, сера и фосфор.

Всем бактериямдля синтеза компонентов клеток необходимы углерод, азот, сера и фосфор. Этиэлементы вместе с Н и О входят в состав клеточных полимеров. Потребность в нихможно рассчитать количественно, зная элементный состав клетки. Он приблизительносоответствует формуле С2Н7О1,5Nплюс небольшое количество Р, S, Fе, щелочных и щелочноземельных металлов, атакже следовое количество микро-элементов. Источником углерода, составляющего50% сухого вещества клеток, обычно служат те же органические соединения,которые используются как источники энергии. Аэробные микроорганизмы, какправило; включают в состав клетки примерно 50% органического субстрата—намногобольше, чем бактерии, осуществляющие брожение (10-20%). Остальное количество органическогосубстрата клетки используют в качестве источника энергии. Все встречающиеся вприроде органические вещества можно рассматривать как потенциальные субстратыдля роста микроорганизмов; при этом предпочтительным для многих бактерийисточником углерода служит глюкоза — наиболее распространенное органическоевещество.

Азот.

Составляющий14% сухого вещества клеток, входит в состав многих природных соединений;бактерии предпочтительно используют его в форме NН4+". Многие бактерии ассимилируютнитрат, мочевину, аминосахара и аминокислоты; последние обычно добавляют всреду в виде белкового гидролизата — пептона. Немногие бактерии способныусваивать молекулярный азот (N2). Потребляемые окисленные формы азота(например, нитрат) восстанавливаются в Клетках до NНз, который включается в метаболизм.

Источниками серы,составляющей менее 1% сухого вещества клеток, в большинстве природныхместообитаний служат органические серосодержащие соединения и лишь в морскойводе — сульфат, концентрация которого составляет в ней <st1:metricconverter ProductID=«28 мМ» w:st=«on»>28 мМ</st1:metricconverter>. К предпочтительноиспользуемым органическим тиолам относятся цистеин, цистин и метионин (ониприсутствуют в пептоне). Лишь немногие микроорганизмы способны использоватьмолекулярную серу. Окисленные соединения серы (например, сульфат)восстанавливаются в клетках до Н2S, который включается в метаболизм.

Фосфор (3% сухого вещества клеток) встречается вприроде обычно в виде фосфатов или фосфорных эфиров. Стабильных (в нормальныхусловиях) восстановленных соединений фосфора не существует. Внутри клетоквосстановления фосфата не происходит, и он включается в метаболизм именно вэтой форме.

Источниками кислородаи водорода, входящих в состав клеточных компонентов, служат для клеток водаи/или органические соединения и лишь в отдельных биосинтетических реакцияхгидроксилирования используется молекулярный кислород (атом (Ы.) кислорода из О2включаются при этом в состав

 ОН-группы).

Неорганическиесоединения используются как минорные, но важные элементы питания.

Для ростамикроорганизмов требуются в небольших количествах ионы щелочных металлов (Nа+, К+) ищелочноземельных металлов (М§2+, Са2"1"),необходимые им в качества электролитов и обеспечивающие протекание различныхкаталитических реакций. Помимо этих металлов, для роста микробов необходим рядэлементов в следовых количествах (их называют микроэлементами), в первуюочередь Fе и в меньшемколичествеZn,Мn, Со, Мо, Сu, Ni, W, Se, V, В и др.Причем не всем бактериямтребуется полный набор этих элементов. Концентрация данных элементов в средахварьирует от миллимолярной (для щелочных и щелочноземельных металлов) домикромолярной (Ре) и меньшей 1 мкМ (10~6-10~8 М дляостальных микроэлементов). При более высоких концентрациях микроэлементыоказывают токсическое действие. Большинство двух- и трехвалентных катионовметаллов при нейтральном или щелочных значениях рН образуют нерастворимыегидроксиды или фосфаты и становятся недоступными для использования бактериями.Поэтому концентрированные растворы неорганических' солей часто хранят ванаэробных условиях при рН < 7 в присутствии небольших количеств комплексообразующихсоединений, таких как ЭДТА или нитрилотриацетат (НТА). Растворимые комплексы сионами многих металлов способны также образовывать некоторые питательныевещества в составе сред (например, ряд аминокислот — Суз, Н1з — и карбоновыхкислот — малат, цитрат). К недостатку металлов в среде, помимо осаждения,приводит Также избыточное хелатирование.

Некоторымбактериям необходимы

витамины длябиосинтеза коферментов.

Бактериям, неспособным синтезировать те или иные витамины, необходимо присутствие их всреде. Многие бактерии нуждаются лишь в каком-либо одном витамине; так, дляроста Е. соliв случае некоторых субстратов требуется витамин В12. Витамины,представляющие собой органические соединения — предшественники или компонентыкоферментов либо простатических групп ферментов — и необходимые клеткам в очень небольшом количестве (от 10~6до 10~7 М), присутствуют во многих природных средах обитаниябактерий как продукты разложения биологического материала. Поскольку ихбиосинтез требует участия многих ферментов, бактериям часто выгоднее несинтезировать их, а поглощать из среды с Помощью высокоаффинных транспортныхсистем. Минимальные потребности большинства бактерий в витаминах удовлетворяетДобавление в среду дрожжевого экстракта (0,1-0,5%), но предпочтительнееиспользовать приготовленные в лаборатории растворы витаминов с точно известнымсоставом. Такие растворы, имеющие слабо-кислый рН, стерилизуют фильтрованием и добавляютв среду для выращивания бактерий только после ее автоклавирования; хранят их в стерильномвиде, на холоду, в анаэробных условиях и в темноте.

Ауксотрофынуждаются в аминокислотах или других факторах роста

Аминокислоты идругие факторы роста служат компонентами или предшественниками клеточныхмакромолекул либо других важных для метаболизма веществ. Присутствие этихвеществ в среде, причем в относительно высоких концентрациях (милимолярных),необходимо для роста бактерий, не способных их синтезировать. К факторам роста,помимо аминокислот, относятся, например, пептиды, пиримидины, пурины, (ненасыщенные)жирные кислоты, холестерол, -мевалоновая кислота, холин, бетаин и полиамины. В сывороткекрови или дрожжевом экстракте могут присутствовать неидентифицированные факторыроста.

Средынеопределенного состава дешевле и удобнее в работе.

Изложенные впредыдущих разделах сведения о питательных потребностях микроорганизмов позволяютсоставлять среды из определенных химических соединений (среды определенного состава,или синтетические среды. Иногда для целей исследования, в первую очередьдля выяснения потребностей объекта, используют минимальные среды, содержащиелишь наиболее необходимые для роста компоненты, При-родные среды чаще всегоотносятся к средам сложного неопределенного состава; для лабораторногокультивирования во многих случаях также применяют среды неопределенного составана основе дешевого пищевого сырья. В качестве источника углерода и энергии влабораторные среды включают крахмал, солод или мелассу, в качестве источниковазота, серы, фосфора и аминокислот — ферментированные, кислотные или щелочныебелковые гидролизаты (пептоны из казеина, соевого белка, мяса или рыбы) либо кукурузныйэкстракт. Для обеспечения аминокислотами, пе

еще рефераты
Еще работы по биологии