Лабораторная работа № 13. ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Иммуногенетика изучает генетический полиморфизм антигенного состава клеток животных. Становление иммуногенетики шло на основе развития гемотрансфузии. Первые иммуногенетические исследования сельскохозяйственных животных были осуществлены Эрлихом и Монгенротом в 1900 г., обнаружившими индивидуальные особенности крови коз; значительный прогресс в этой области был достигнут в 40-50 годах нашего столетия, когда впервые были получены антитела к ряду антигенов эритроцитов.

Антигены расположены на поверхности эритроцитов и имеют строго определенную пространственную структуру; по химической природе это гликопротеиды и гликолипиды.

У крупного рогатого скота на сегодняшний день выявлено свыше 80 антигенных факторов, составляющих 12 систем групп крови. При таком количестве антигенных факторов возможно бесчисленное множество их сочетаний, поэтому исключается существование животных, имеющих одинаковый тип крови. Набор антигенных факторов на поверхности эритроцитов индивидуален для каждого животного и в течение жизни не меняется. Антигенные факторы передаются по наследству, поэтому у потомков могут быть только те антигены, которые есть у его родителей. Установлено, что ряд антигенов наследуется независимо друг от друга, а часть антигенов образуют группы сцепления. Двенадцать систем групп крови контролируются 12 локусами разных хромосом. В пределах каждой системы, - группы крови наследуются как простые признаки. В каждом локусе представлены два аллеля: один от отца, - второй от матери, которые наследуются кодоминантно. Существуют однофакторные и многофакторные системы групп крови, распределение антигенов по системам представлено в приложении 8.
Для выявления набора антигенных факторов животного проводят тестирование крови.

Ход работы:

Тестирование типов крови у крупного рогатого скота.

Кровь для анализа в количестве 10 мл забирают шприцом из яремной вены в пробирки, содержащие 3-4 мл антикоагулянта. Затем перемешивают, подписывают, указывая инвентарный номер и кличку животного, закрывают пробкой и до проведения анализа хранят в холодильнике при 4°С. Не рекомендуется хранить кровь более 10 суток. Антикоагулянт состоит из 1% глюкозы, 5% цитрата натрия, на 0,9% NaCl с добавлением 5000000 ед. стрептомицина на 1 л физиологического раствора.

Оборудование и реактивы.

Подготовка материала к анализу.

Для выполнения анализа необходимо подготовить эритроциты исследуемых животных, комплемент и наборы стандартных реагентов.

Для выполнения анализа необходимо приготовить взвесь эритроцитов 2,5% концентрации. С этой целью в центрифужную пробирку на 10 мл вносят 1,5-2 мл крови и добавляют 5 кратный объем физиологического раствора, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин 10 минут. Надосадочная жидкость отсасывается водоструйным насосом, в пробирки добавляют физиологический раствор, перемешивают с осадком эритроцитов и вновь центрифугируют. Затем надосадочная жидкость повторно отсасывается, дозатором отбирается 0,05 мл упакованных эритроцитов и помещается в пробирки с разлитым по 2 мл (в каждую) физиологическим раствором.

Комплемент.

В качестве комплемента используется свежая сыворотка крови кролика. Кровь в количестве 50 мл отбирается путем поперечного надреза краевой вены уха кролика. Свернувшаяся при комнатной температуре кровь разрезается на сегменты, сыворотка сливается в центрифужные стаканы и центрифугируется при 3000 об/мин для удаления эритроцитов. После центрифугирования сыворотку можно использовать для постановки реакции. Длительное хранение сыворотки возможно при температуре -20°С. После размораживания сыворотку нужно использовать в тот же день, поскольку ее активность резко снижается.

Гемолитический тест.

Факторы крови крупного рогатого скота выявляют по реакции гемолиза эритроцитов в присутствии соответствующего реагента и комплемента.

Для выполнения анализа собирают набор из 6 иммунологических планшет. Пластины предварительно маркируют, - на верхнем бортике пишут номера, по горизонтали - символы реагентов.

В горизонтальные ряды лунок в соответствии с обозначением вносят шприцом по 2 капли реагента в каждую лунку по всей длине ряда, в последнюю лунку вместо реагента вносят по 2 капли физиологического раствора. В вертикальные ряды лунок вносят по 2 капли 2,5% суспензии эритроцитов анализируемого животного (по всей длине ряда) в соответствии с приведенными номерами. Через 20 минут в каждую лунку вносят по одной капле комплемента.

Пластины хорошо встряхивают, постукивая о борт, чтобы содержимое лунок перемешалось, но не выплеснулось и помещают в термостат при температуре 28-30°С на 2 часа. В ходе инкубации пластины дважды встряхивают. После 2-х часовой инкубации проводят первую читку реакции, после чего пластины вновь помещают на час в термостат, затем читку реакции повторяют.

Реакцию оценивают визуально, оценку выражают в баллах и результат вносят в бланк протокола "серологический тест".

Шкала оценки реакции:

• - точка, или отсутствие гемолиза;

1 - один балл - слабозаметное покраснение жидкости в виде ободка, эритроциты лежат плотным осадком;

2 - два балла - жидкость умеренно окрашена, осадок эритроцитов уменьшен;

3 - три балла - жидкость красная, на дне лунки небольшое количество эритроцитов;

4 - четыре балла - жидкость красная, эритроциты полностью гемолизированы.

Баллы 3 и 4 означают положительную реакцию, баллы 1 и 2 - реакция сомнительная и требует перепроверки. Кроме того, реакция требует перепроверки, если в лунках, содержащих вместо реагентов физиологический раствор, произошел гемолиз, т.к. эти лунки являются контрольными.

Анализ результатов тестирования.

Данные, полученные при чтении реакций, разносят в протокол "серологический тест" в соответствии со шкалой оценок. В бланке протокола антигенные факторы, обозначенные буквами латинского алфавита, распределены по системам групп крови. Положительная реакция, оцененная в 3 - 4 балла, означает, что данный антигенный фактор присутствует на поверхности эритроцитов, исследуемого животного. Комплекс выявленных антигенных факторов является типом крови данного животного.

При определении достоверности происхождения потомства принят следующий порядок оформления данных анализа: в бланк "типы крови КРС", сначала вписывают тип крови отца, строкой ниже - матери, следом тип крови потомка. Чтобы определить генотип потомка необходимо установить аллели, унаследованные потомком от отца и матери по всем генетическим системам групп крови.

Определение достоверности происхождения потомства основано на принципе исключения, т.е. потомок не должен иметь факторов крови отсутствующих у его родителей. Если у потомка выявляются аллели, отсутствующие у родителей в одной или нескольких системах, отрицается достоверность его происхождения. Отцовство отрицается, если у потомка обнаруживаются аллели, отсутствующие у отца, материнство - если отсутствуют одна или несколько материнских аллелей (феногрупп).

Животных, достоверность которых не подтвердилась в ходе анализа исключают из числа племенных.

Иммуногенетика открывает возможности управления селекционным процессом на основе генетических маркеров. Рассмотрим некоторые аспекты практической реализации иммуногенетического мониторинга в племенном молочном скотоводстве.

Чистопородное разведение:

- характеристика генофонда и генетической структуры стада или породы;

- определение достоверности происхождения потомков;

- определение селекционной и генетической дифференциации групп животных;

- определение коэффициента генетического сходства линий;

- ранний прогноз возникновения инбредной депрессии;

- подбор родительских пар на основе генетических маркеров.

Межпородное скрещивание:

- прогнозирование гетерозисного эффекта;

- определение генетического расстояния между породами;

- определение в каждом конкретном случае истинных помесей и генетический возврат к исходным родительским породам при разведении помесей "в себе";

- определение истинной степени кровности, т.е. долю участия генотипов каждого из родителей в потомке в каждом конкретном случае.