Реферат: Епізоотологічні особливості грипу птахів в Україні

--PAGE_BREAK--Аналіз проводили за допомогою діагностичної тест-системи “Птах–Грип–ПЛР–РЧ” для виявлення РНК вірусу пташиного грипу А/H5N1 методом полімеразної ланцюгової реакції у режимі реального часу, ТУ 24.4–23524007–064–2006, серія 001/AIV/RG–100, згідно з настановою з використання діагностичного набору. Кожен зразок досліджували у двох повторах. Ампліфікацію у реальному часі проводили в реактивній суміші об’ємом
25 мкл. Ампліфікацію кДНК мішені здійснювали на приладі Rotor-Gene 3000, Corbett research (Австралія), з таким температурним профілем: активація урацил-ДНК-глікозидази – 5 хв при +50 °С, активація ДНК-полімерази – 10 хв при +94 °С та наступні 40 циклів ампліфікації, які включали денатурацію – 30 с при +94 °С, відпал праймерів – 30 с при +58 °С, елонгацію – 30 с при +72 °С. Аналіз результатів здійснювали за допомогою програмного забезпечення RG operating software, version 6.0.33.
Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3,1”, згідно з інструкціями виробника. ПЛР-продукти клонували у бактеріальний вектор pBluescript II SK+(Stratagene) за загальноприйнятими методами генної інженерії (Sambrook J. et al., 1989). Визначення нуклеотидної послідовності продуктів ампліфікації вірусу пташиного грипу проводили на генетичному аналізаторі ABI 3130 (Applied Biosystems) із використанням набору реагентів “BigDye®terminator, v.3.1”, згідно з інструкціями виробника. Комп’ютерний аналіз даних проводили з використанням пакета програм Vector NTA v. 9.1 (Invitrogen) та Інтернет-ресурсів: BLAST, ClustalW, WebPhylip.
У частині дослідів вивчали морфофункціональні зміни у риб при експериментальному заражені ізолятом “A(chironomida) Azov/11/2006(H5N1)” вірусу грипу птахів. Зараження однорічок коропа (Carpio carpio) здійснювали через ін’єкцію в черевну порожнину вірусовмістимої алантоїсної рідини курячих ембріонів та матеріалу, одержаного із мотиля з титрами в РЗГА 1:64 та в РГА 1:256. Однорічним коропам двох експериментально заражених груп (в кожній по 15 риб) уводили внутрішньочеревно 0,1 та 0,2 см3 ізоляту “A(chironomida)Azov/11/ 2006(H5N1)” вірусу грипу птахів, а одній контрольній групі (15 риб) вводили розчин Рінгера. Риб витримували в окремих 10-літрових акваріумах з постійною аерацією та температурою +20±1 єС. З початку досліду кожні 24 години протягом перших 3 діб відбирали з кожної групи по 3 екземпляри, в яких брали кров із серця. Інших коропів досліджували на 5 та 10 добу. З тулуба коропів готували гомогенати, які зберігали при температурі +8±2 єС. З крові одержували сироватку, в якій визначали вміст білка (Loury et al., 1951), білкові фракції (альбумін, глобулін) турбодемитричним методом та активність лізоциму дифузним методом на агарі (Лабінська А.С., 1978). У коропів дослідних та контрольної груп визначали масу, довжину, коефіцієнт вгодованості за Фультоном, абсолютну (мг) та відносну (індекс ‰) масу імунокомпетентних органів (гепатопанкреас, нирка та селезінка). З імунокомпетентних органів виготовляли екстракти тканин (1:50), в яких визначали вміст водорозчинного білка та активного лізоциму. Проводили підрахунок кількості еритроцитів та лейкоцитів у десяти полях зору мікроскопа (при збільшенні − 60Ч7) з одного мазка крові риб та визначали співвідношення кількості лейкоцитів (Л) до кількості еритроцитів (Е) у полі зору − Е/Л (Кушманова О.Д., Івченко Г.М., 1978; Строев Е.А., Макарова П.П., 1986). Через 10 діб у риб дослідної та контрольної груп визначали лізоцим та бактерицидну активність сироватки крові (БАСК) (Смирнова А.В., Кузьмина Г.А., 1966).
В експерименті з вивчення п’явки як можливого компоненту резервуара збудника використали 30 медичних п’явок (Hirudo medicinalis). Зараження проводили алантоїсною рідиною з інфікованих штамом “A(chironomida) Azov/11/2006(H5N1)” 10-добових курячих ембріонів. Було сформовано 8 дослідних та 2 контрольні групи п’явок (по 3 екземпляри в кожній). Восьми дослідним групам п’явок внутрішньоцеломно вводили алантоїсну рідину, що містила вірус пташиного грипу в кількості 108,45 ЕЛД50/0,1см3, 107,45 ЕЛД50/0,1см3, 106,45 ЕЛД50/0,1см3 і 105,45 ЕЛД50/0,1см3 відповідно. П’явкам контрольної групи вводили стерильний 0,9 %-й розчин NaCl. Доза введення 0,125 см3. П’явок утримували у флаконах з водою об’ємом 400 см3, закритих гумовими пробками з отворами. Через 5 та 45 діб після початку експерименту п’явок заморожували, потім розморожували і готували суспензію на стерильному фізіологічному розчині та досліджували методом ПЛР на наявність РНК вірусу пташиного грипу.
Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятою методикою (Плохинський М.А., 1980), використовуючи комп’ютерну програму Microsoft Office EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ
Наявність домашніх птахів на птахофабриках АР Крим та коротка характеристика місць мешкання диких птахів, рекомендованих Європейською комісією для дослідження на пташиний грип. Створені нами карти-схеми наявності поголів’я птахів на птахофабриках АР Крим та спеціалізації птахогосподарств України свідчать, що значна кількість поголів’я птахів утримується на промислових птахофабриках. Масові сезонні міграції пернатих сприяють виникненню безпосередніх контактів між дикими та домашніми птахами. Порушення технології вирощування птахів на промислових підприємствах може також зумовити контакти диких та синантропних птахів з промисловими. Дикі та синантропні птахи можуть бути джерелом та резервуаром збудника пташиного грипу для домашніх і промислових птахів. Європейською комісією рекомендований перелік диких та синантропних видів птахів, які можуть бути носіями вірусу грипу. Відповідно до переліку ми проаналізували наявність перелітних видів птахів у АР Крим. Нами наведена стисла характеристика довкілля, біології та місць проживання диких птахів на півдні України. Описані представники 7 родин (25 видів) перелітних та зимуючих диких птахів, зареєстрованих у районі оз. Сиваш (Костин А.В., 1983; Андрущенко А.Н. и соавт., 1999). Із наведених видів птахів найбільш поширені озерна чайка – 80 000 екз., крижень – 62 300 екз., чирок-тріскунок – 51 896 екз., поганка – 50 438 екз., великий баклан – 29 000 екз., червоноголова чернь – 18 018 екз., біла чапля – 15 225 екз., основним кормом яких є рачки, личинки комах, молюски і риби (бички, тарань, карась, сазан). У значно меншій кількості (500–2000 екз.) у Криму зустрічаються такі перелітні та зимуючі птахи: чирок-свистунок, широконоска, чибіс, турухтан, чернь чубатий, лебідь-шипун, звичайний шпак, у кормі яких наявні тваринні та рослинні компоненти. Чисельність інших птахів у оз. Сиваш коливається від 200 до 500 екз. (білий лелека – 201, білолобий гусак – 250, сіра качка – 479, свищ – 360, перепілка – 300, деркач – 300, чорноголовий хохотун – 478, грак – 300).
Наведений перелік птахів свідчить про їх надзвичайне видове різноманіття, сконцентроване на відносно обмеженій території, що забезпечує можливість тісного міжвидового контакту та створює умови для тривалої циркуляції й пасажування різноманітних патогенів, зокрема збудника пташиного грипу. Види диких птахів, що годуються водними мешканцями, слід досліджувати при аналізі зон підвищеного ризику, пов’язаного з неблагополуччям з пташиного грипу.
Ураження птахів різних видів вірусом грипу в регіонах України. Моніторингові дослідження на грип птахів в Україні почали проводити з 2003 року. В 2003 році було досліджено в РЗГА 3700 сироваток крові птахів, із них виявлено серопозитивних (до гемаглютиніну Н6): всього 3 голови у Херсонській області. В 2004 році було досліджено 20513 птахів різних видів і категорій. При цьому антитіла були виявлені до Н2 та Н6 в 107 пробах сироваток крові. В 2005 році було досліджено 91861 голів. Антитіла були виявлені в 148 пробах сироватки крові. При цьому у 18 пробах виявлено антитіла до H5, а в інших пробах – до H2 та H9. В 2006 році було досліджено на грип 307024 проби, в т.ч. диких птахів – 17104, синантропних птахів – 15890, птахів приватного сектору – 168274 та птахів у птахогосподарствах – 105756 проб. У першому півріччі 2007 року досліджено 144967 проб сироватки крові і виявлено 31 серопозитивну пробу до H2 та H9 в АР Крим, Полтавській, Харківській, Херсонській, Тернопільській та Черкаській областях.
Серед водоплавних птахів різних видів провідне місце за кількістю та різноманітністю ізольованих вірусів грипу посідають птахи підряду гусеподібних. Але сприйнятливість птахів різних видів одного ряду до вірусів грипу може відрізнятися. В екологічному відношенні серед диких видів птахів, від яких були ізольовані віруси грипу, домінують види, що надають перевагу водним та навколоводним місцям проживання (дикі гуси, дикі качки, лиски, баклани). Птахи виду дрозд роблять гнізда в сухих рівнинних місцях, а вид павичі – в місцях проживання, без обов’язкової наявності великих водойм. Можна припустити, що таксономічна та екологічна гетерогенність диких птахів, які є носієм вірусу грипу на території України, пояснюється наявністю великої кількості водойм, які придатні для гніздування птахів. Очевидно, гетерогенність диких птахів може бути дуже сприятливою умовою для реасортації геномів різних штамів вірусу грипу.
Вивчення антигенної структури високопатогенного штаму вірусу грипу Н5N1, виділеного в період епізоотії хвороби у 2005–2006 роках. На півдні України епізоотичний спалах високопатогенного пташиного грипу (ВППГ) був зареєстрований у листопаді 2005 р. у господарствах приватного сектору серед курей, індиків, качок та гусей. Аналіз патологічного матеріалу показав, що ізолят збудника, виділеного в Криму “А/chiken/Crimea/1/2005(H5N1)”, що викликав епізоотію, споріднений вірусу А H5N1, який був виділений раніше від хворих птахів у Росії, Китаї та Монголії. За геном гемаглютиніну спорідненість їх становила від 99,2 до 99,8 %, а за геном нейромінідази – від 99,5 до 99,7 %.
Результати досліджень патологічного матеріалу від хворих птахів із Криму в референтних ветеринарних лабораторіях VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральної державної установи “Федеральний центр охорони здоров’я тварин” (Володимир, Росія) і Федеральної державної установи “Центральний науково-дослідний інститут епідеміології” (Москва, Росія) підтвердили наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу (ВПВПГ) H5N1, який зумовив епізоотію у цей період (табл. 1).

Таблиця 1 – Дослідження на високопатогенний грип птахів
Подальші спалахи ВППГ (до 16.07.2006 р.) серед приватних та диких птахів у Одеській, Херсонській, Сумській областях, а також у м. Феодосія, діагноз хвороби яких контролювався референтними лабораторіями, засвідчив про циркуляцію раніше виділеного штаму “А/chiken/Crimea/1/2005 (H5N1)”.
Молекулярно-генетичними дослідженнями не було виявлено мутантів цього штаму вірусу, які містили б комплементарні до епітелію людини рецептори, а також тих, що були резистентні до лікувальних препаратів (ремантодину, амантодину та озельтамівіру).
Одержані дані дозволили створити карту-схему поширення високопатогенного грипу птахів територією України за період 2005–2006 рр. (рис. 1).
На карті зазначені епізоотичні вогнища високопатогенного пташиного грипу, які були виявлені в АР Крим, Одеській, Херсонській та Сумській областях.
Молекулярно-генетичний аналіз вірусу пташиного грипу, виділеного із системи оз. Сиваш. У листопаді 2006 – квітні 2007 року нами були здійснені експедиційні виїзди та відбір проб матеріалу (мотиль, мул, креветки, пеленгас) з місць, де спостерігалось захворювання диких птахів у травні 2006 року. Вищезазначені проби досліджували у ПЛР у реальному часі і проби, у яких ПЛР давала позитивний результат, були використані для зараження та проведення трьох пасажів на курячих ембріонах. Результати проведених досліджень матеріалу на наявність високопатогенного вірусу пташиного грипу А H5N1 наведені в табл. 2. З неї видно, що спостерігалась загибель курячих ембріонів, які були заражені пробами патологічного матеріалу від мотиля, алантоїсна рідина яких виявилась позитивною в ПЛР (А/H5N1). При дослідженні в ПЛР позитивними також виявились проби зразків із пеленгаса та мулу, а проби із креветок дали негативний результат.
Фрагменти ПЛР позитивного зразка від мотиля клонували у плазмідний вектор та визначали їх нуклеотидну послідовність. На підставі трьох сіквенсів ізоляту пташиного грипу був проведений філогенетичний аналіз. У подальшому, використовуючи веб-браузер BLAST-P, проведено пошук по базах даних GenBank, EMBL, BDBI та PDB, найбільш споріднених до визначеного нами фрагмента вірусу пташиного грипу, амінокислотних послідовностей інших ізолятів вірусу.
Таблиця 2 – Дослідження матеріалу із ставів оз. Сиваш на наявність вірусу високопатогенного грипу H5N1
Примітки: 1. У цій та наступних таблицях: (+) – позитивний результат дослідження; (–) – негативний результат дослідження;
2. НД – матеріал не досліджували.
На підставі одержаних результатів були побудовані філогенетичні дерева і встановлено наявність нового ізоляту штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H5N1)”. З’ясувалось, що цитопатична дія нового штаму (визначали шляхом зараження моношарових культур фібробластів ембріонів курей) проявлялась через 48 годин та завершувалась впродовж 72-х годин. Титр вірусовмістимої рідини штаму “A(chironomida)Azov/11/2006(H5N1)” на культурі курячих фібробластів становив 105,9ЦПД 50/0,1см3, а на курячих ембріонах − 108,45ЕЛД 50/0,1см3.
Зміни гістоструктури курячих ембріонів, заражених вірусом грипу штаму “А(chironomida)Azov/11/2006/(H5N1)”. Встановлено, що виділений нами штам “А(chironomida)Asov/11/2006 /(H5N1)” у трьох проведених пасажах на курячих ембріонах проявляє цитопатогенну дію і зумовлює загибель ембріонів через 48 годин. Патогенна дія у ембріонів проявляється ураженнями головного та спинного мозку, мозкових оболонок, що формуються, та ендотелію кровоносних судин, які мають запальний характер. Також відмічається розвиток жирової дистрофії гепатоцитів та зернистої дистрофії нефроцитів.
    продолжение
--PAGE_BREAK--