Реферат: Хламидиоз. Методы определения/диагностики
ХЛАМИДИОЗ — СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ
Цитоскопическиеметоды обнаружения хламидий
При цитоскопическом методе одновременно с поиском цитоплазматических клеток-включений Провачека учитывается количество лейкоцитов как показателя воспаления, а также дополнительная информация о наличии сопутствующей бактериальной микрофлоры, дрожжеподобных грибов, трихомонад и т.п.
Показания: Острая фаза заболевания.
Материалом для исследования служат соскобы из уретры у мужчин и уретры и /или цервикального канала у женщин. Материал берут специальными щеточками или ложечками Фолькмана. Выделения из цервикального канала удаляются ватным тампоном. Щеточка вводится в канал на 1-2 см, вращается 15 секунд. Соскобный материал распределяется на предметном стекле, высушивается на воздухе и фиксируется в метаноле или холодном ацетоне. Наиболее популярна окраска по Романовскому-Гимзе. После окраски препараты просматриваются в световом микроскопе, используя иммерсионный объектив (х90). При этом цитоплазма клеток окрашивается в голубой цвет, ядра в фиолетово-синий, цитоплазматические включения определяются в виде темно-синих или розовых микроколоний на фоне голубой цитоплазмы. На стадии элементарных включения хламидий окрашиваются в розовый цвет, на стадии элементарных телец -в синий.
Цитоскопическийметод широко доступен, но эффективен лишь при острых формах инфекции, значительно менее эффективен и информативен при хронических формах заболевания При урогенитальном хламидиозе частота обнаружения телец Провачека в соскобах уретры и цервикального канала не превышает 10-12 %. Наличие этих телец подтверждает диагноз хламидиоза, однако их отсутствие не исключает наличие инфекции.
Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ)
Этот метод предусматривает прямое выявление антигенов хламидий. При люминесцентной микроскопии включения хламидий определяются в виде зеленой или желто-зеленой флюоресценции включений на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток Включения могут иметь зернистую гомогенную или смешанную структуру.
Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:
1.Острая фаза заболевания.
2.Хроническая фаза заболевания
3 Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта
4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом
5. Бесплодие неясного генеза.
Диагностическая информативность ПИФ связана с тем, что с ее помощью выявляются не только корпускулярные, но и растворимые антигены хламидий Этот метод не зависит от возможного изменения тинкториальных свойств микроорганизма в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является важнейшим скриннинговым методом диагностики урогенитального хламидиоза. Его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител составляет соответственно 65-90% и 85-90%. При оценке результатов следует учитывать, что только показатели внутриклеточной флюоресценции могут оцениваться в качестве положительного результата этого теста при использовании поликлональных антихламидийных антител, при использовании моноклональных — результат считают при наличии 10 ЭТ в поле зрения. Соскобные препараты готовят также, как и для цитоскопических исследований.
Выпускают диагностические наборы, содержащие моноклональные антитела для ПИФ, следующие фирмы: Syva, Drfco, Kallastad, Bartrels, Boots celltech, California Integrated Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенты фирм Syva, Difco, Kallastad представляют собой меченные ФИТЦ моноклональные антитела к основному белку наружной мембраны хламидий, а реагенты других фирм — моноклональные антитела к родоспецифическому хламидийному липолисахариду (ЛПС). В России ЗАО “НИАРМЕДИК плюс” при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН выпускает моноклональные антитела к ЛПС хламидий, которые успешно конкурируют с продукцией иностранных фирм по качеству продукции. Это набор “Хламоноскрин” для определения моноклональных антител к родоспецифическому липополисахаридному антигену и набор “Хламоноскрин-2” для определения моноклональных антител к видоспецифическому белковому антигену хламидий трахоматис. Наборы имеют ФС 42-359598 и регистрационное удостоверение Минздрава России 93/ 270/ 9 .
Моноклональныеантитела отличаются друг от друга по вызываемой яркости свечения, постоянству выявляемых форм ЭТ и степени специфичности. Для диагностики хламидий этим методом необходим люминесцентный микроскоп.
В целом, метод ПИФ отвечает критериям высокой чувствительности и специфичности, но требует исполнения опытным, компетентным лабораторным работником.
Высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко бывает доступной, поэтому средняя чувствительность его снижается. Метод недостаточно чувствителен и для стабильного определения малых количеств ЭТ. К тому же невозможно проверить и отрицательные результаты, и, следовательно, обнаружить среди них ложноотрицательные, что приводит к снижению чувствительности.
Иммуноморфологические методы
Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций хламидий в эпителии и других тканях путем обработки препаратов специфическими антителами. Антитела диагностической антихламидийной сыворотки соединены с какой-либо меткой — люминесцирующей (ФИТЦ-антитела) или ферментной (энзим-меченые антитела).
Непрямой метод иммунофлюресценциии
Непрямой метод иммунофлюресценции применяют в тех случаях, когда нет в наличии ФИТЦ-конъюгата антихламидийных антител. В этих случаях приготовленный тем же методом, что и для ПИФ препарат из клинических проб обрабатывают вначале антихламидийными антителами, полученными путем иммунизации хламидиями овец, кроликов, мышей или других животных, а затем второй сывороткой, специфичной для вида животного, которое было иммунизировано хламидиями. Антитела второй сыворотки конъюгированы с ФИТЦ. Показания к применению и специфичность данного метода совпадают с ПИФ.
Методы иммуноферментного анализа
Эти методы основаны на обнаружении растворимого антигена хламидий в исследуемых пробах. Чаще используются наборы реактивов Imx Select Хламидия (Abbott Laboratories) и Chlamydia-antigen Elisa (Medac Diagnostica).
Тест Imx Select Хламидия основан на технологии ИФА-анализа на микрочастицах (МИФА) и предназначен для качественного определения липолисахаридного антигена С. trachomatis в эндоцервикальных и уретральных мазках на анализаторе Imx. Данный набор содержит компоненты, полученные из человеческого материала, что обуславливает соблюдение при работе правил биологической безопасности.
Узел пробоотборник/электрод добавляет микрочастицы в лунку, содержащую образец. Предварительно экстрагированный липолисахаридный антиген (ЛПС) образца связывается с микрочастицами. Аликвота реакционной смеси, содержащей комплексы микрочастиц с ЛПС-антигеном, переносится на стекловолокнистый матрикс реакционной ячейки. Микрочастицы необратимо связываются с матриксом. К матриксу добавляются кроличьи антитела против хламидий. Они связываются с ЛПС антигеном. Биотинилированные козьи анти-кроличьи антитела добавляются к матриксу и связываются с комплексом анти-хламидия/ЛПС антиген. К матриксу добавляется конъюгат щелочной фосфатазы и антител против биотина. Происходит связывание конъюгата с комплексом антиген/антитело. После удаления не связавшегося материала промыванием к матриксу добавляется субстрат 4-метилумбеллиферилфосфат. Образование флуоресцирующего продукта измеряется в оптическом узле МИФА.
Тест-система Chlamydia-Antigen-ELISA medac (регистрационное удостоверение Минздрава РФ 97/128 от 07.02.97 г.) является экономным и в то же время достаточно специфичным и чувствительным методом в рутинной диагностике хламидийной инфекции. Этот тест представляет собой метод твердофазного ИФА-анализа для определения антигенов хламидий. Твердая фаза покрыта хламидийными моноклональными антителами установленной специфичности. Амплификация достигается с использованием технологии полимерной конъюгации, в результате чего происходит фиксация, при которой на каждый связанный участок антигена приходится полимерный комплекс с высокомолекулярным фрагментом. Кроме того, амплификация выполняется на стадии обозначенного воспроизведения с использованием запатентованной технологии фермент-амплификации. Визуально положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена хламидий. Точный результат исследования определяют с помощью микроЭВМ, спектрофотометра “Мультискан” или другого аппарата для ИФА при длине волны 492 нм. Образцы дающие значения поглощения выше или равные значению отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными для хламидий. Чувствительность и специфичность ИФ методов соответственно составляет 65-70% и 90-100%. Показания к применению такие же, как и для метода прямой иммунофлюресценции. Выявление в сыворотке крови антител к липополисахаридному антигену хламидий классов Ig G, Ig A, Ig M с определением их титра позволяет определить стадию заболевания, обосновать необходимость антибактериального лечения и оценить его эффективность.
Показания к выявлению антихламидийных антител классов Ig G, Ig А, Ig M в сыворотке крови методом ИФА
1. Определение стадии заболевания;
-острая, первичная;
-хроническая;
-реактивация или реинфекция;
-состояние после реконвалесценции (остаточная серология).
2.Оценка эффективности проводимого лечения (наряду с исследованием методами ПЦР, культурального посева).
3.Установление хламидийной этиологии экстрагенитальных поражений (артриты, пневмонии, заболевания глаз).
Сравнивая различные диагностические наборы, мы рекомендуем использовать тест-систему r-Elisa фирмы MEDAC DIAGNOSTICA (Германия). Регистрационное удостоверение Минздрава РФ 97 от 7.02.97 г. Это иммуноферментные наборы для выявления антихламидийных антител классов Ig G, Ig A, Ig M с определением их количественного титра в сыворотке крови по одной точке. Антиген получен методами генной инженерии. В качестве антигена твердой фазы используется специфические рекомбинантные липополисахаридные фрагменты хламидий, отсутствующие в липополисахаридах других бактерий. Выбирая тест-систему, где в качестве антигена используются липополисахаридные фракции, мы исходили из предположения, что обследуемое лицо может в течении жизни подвергаться инфицированию не только C.trachomatis, но и С.pneumonia, и C.psitacci с выработкой к ним соответствующих антител. Выявление их количественного титра и его динамики является важнейшим показателем эффективности проводимого лечения.
В промежутке между пятым и двадцатым днями после появления клинических симптомов заболевания последовательно возникают антитела этих трех классов к специфическому хламидийному липополисахариду. Ig M является маркером острой стадии, он определяется уже через пять дней после начала заболевания. Изменения продуцирования Ig M на определяемое продуцирование Ig А может происходить в течение 10 дней после появления симптомов заболевания. В течение короткого периода могут одновременно присутствовать Ig M и Ig А. В это же время или с небольшой задержкой — 2-3 недели могут быть определены Ig G. Прогрессирование заболевания, переход в хроническую стадию характеризуется появлением Ig A. Ig G- антител (смотри таблицу 3).
Таблица 3. Определение стадии заболевания на основании выявления антител классов Ig G, Ig A, Ig M
Стадия заболевания
Классы антител
Острая
IgG, Ig А, Ig M
Хроническая
IgA*, Ig G
Реактивацияили реинфекция
IgA*, Ig M
Состояние после реконвалесценции
IgG
*-при недостоверном определении титра Ig А подтверждение осуществляется при помощи определения Ig M.
Для адекватной интерпретации результатов серодиагностики хламидиоза следует определять такое понятие как 'пограничные титры Это наименьшие возможные разведения в которых тест-системы определяют антитела против хламидий. “Пограничные титры” для Ig M — 1:50, Ig А-1:50, Ig G-1:100. Так называемые “диагностические титры” могут подтверждать клинический диагноз, стадию процесса необходимость назначения антибактериального лечения (смотри таблицу 4). При реинфекции и реактивации происходит скачкообразный подъем титров Ig G изменения титра Ig А идут параллельно с титром Ig M однако на более низком уровне. У лиц, не получающих в период реинфекции лечения, титр Ig G сохраняется на неизменном уровне. Выявление на протяжении длительного периода титра только Ig G указывает на состояние реконвалесценции после перенесенной хламидийной инфекции (“серологические шрамы”). Исследуя титры антител Ig G, Ig A, Ig M можно оценивать эффективность проведенного лечения в отдаленном периоде (через 1-1,5 месяца).
В табл. 5-17 показана возможность определения стадии инфекционного процесса, показаний к антибактериальному лечению и вынесения заключения о наличии хламидииной инфекции на основании однократного или динамического определения титров антител IgG, IgA, IgM.
Таблица 4. Диагностический диапазон титров антител Ig G, Ig А, IgM. Выявление на основе его оценки стадии заболевания, обоснованности назначения антибактериального лечения.
Стадия заболевания
Дипазонтитров IgG
Диапазон титров IgA
Диапазон титров Ig M
Первичная/острая. Определяются Ig M
>100-6400
> 50-1600
> 50-3200
Хроническая. Определяются Ig A
> 100-1600
<50
>50-200
Реактивация/ Реинфекция. Определяются Ig G, Ig A
>100-51200
>50-400
<50
Состояние после реконвалесценции. Определяется Ig G
> 100-400
<50
<50
Рассмотрим возможность определения стадии инфекционного процесса, показаний к антибактериальному лечению и вынесения заключения о наличии хламидийной инфекции на основании однократного или динамического определения титров антител Ig G, IgA, Ig M.
Используя данные однократного исследования затруднительно вынести клиническое заключение (табл. 5), при исследовании сыворотки через 10-14 дней уже можно судить о наличии хламидийной инфекции и показании к назначению антибактериального лечения (табл. 6) или об их отсутствии (табл. 7)
Таблица 5. Очень ранняя стадия инфекции (сомнительно). “Пограничные титры” в первой сыворотке
Титр Ig G
Титр Ig А
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
<100
|<50
|<50
сомнительно
не показано
Таблица 6. Острая первичная инфекция. “Диагностические титры” во второй сыворотке через 10-14 дней
Титр Ig G
Титр Ig А
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидииной инфекции
Антибактериальное лечение
>200
>=100
=<50
имеется
Показано
Таблица 7. Отсутствие хламидийной инфекции. “Диагностические титры” во второй сыворотке через 10-14 дней
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
<100
<50
<50
отсутствует
не показано
При однократном определении титров антител (табл. 8) так же, как и в предыдущем наблюдении трудно однозначно вынести клиническое заключение Повторное обследование больного через две недели (табл. 9) позволяет судить о прогрессировании первичной инфекции либо реактивации и реинфекции. В другом случае (табл. 10) исследование сыворотки в динамике через две недели позволяет вынести заключение о персистенции антител и непоказанности антибактериального лечения
Таблица 8. Ранняя стадия инфекции (сомнительно). Хроническое течение (сомнительно). “Пограничные титры в первой сыворотке”
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
100
50
<50
Сомнительно (требуется подтверждение ПЦР и культуральным посевом)
не обязательно
Таблица 9. Прогрессирующая первичная инфекция. Реинфекция. Реактивация. Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
>=400*
>=200*
<=50
Имеется
показано
*- 4-х кратное повышение значимо только для Ig G и Ig А.
Таблица 10. Хроническая персистенция антител без клинических проявлений. Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней.
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
100
50
< =50
Персистенция антител
не показано
В следующем наблюдении (табл.11) можно сразу вынести заключение о первичной инфекции или о ее прогрессировании либо реактивации, реинфекции (табл.12) и, соответственно, показанности антибактериального лечения.
Таблица 11. Первичная стадия. Диагностические титры в первой сыворотке
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
<100
<50
>=50
Имеется
Показано
>=100
>=50
>=50
Имеется
Показано
<100
>=50
>=50
Имеется
Показано
Таблица 12. Прогрессирующая первичная инфекция. Реинфекция. Реактивация. Диагностические титры первой сыворотки
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
>=400
>=200
<50
имеется
показано
В следующем наблюдении первичное исследование не дает оснований для выводов (табл.13), и только повторение его через две недели позволяет вынести заключение. Отсутствие изменения титра антител (табл.15) за указанный период времени свидетельствует о персистенции хламидий, вызывающих образование Ig А-антител и об отсутствии показаний к назначению антибактериального лечения. В другом случае (табл.14) увеличение в 2 раза титров Ig G и Ig A позволяет сделать вывод о присутствии хламидийной инфекции и наличии показаний к назначению антбактериального лечения.
Таблица 13. Первичная инфекция (сомнительно). Реинфекция (сомнительно). Реактивация (сомнительно). “Пограничные титры” в первой сыворотке
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
<100
50-100
<50
Возможна
Сомнительно. Не обязательно
Таблица 14. Первичная инфекция. Реинфекция. Реактивация. “Диагностические титры” во второй сыворотке через 10-14 дней
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
>=200
>=200
<50
Имеется
Показано
Таблица 15. Хроническая персистенция антител без клинических проявлений. Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней.
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
<100
50-100
<50
Присутствует персистирующие хламидии, вызывающие образование IgA-антител. Клининическое значениенеизвестно.
Не показано
В случае обследования реконвалесцентов или при выявлении повышенных титров IgG, расценивающихся как “серологическая находка” (табл. 16), динамическое наблюдение через две недели в случае отсутствия 4-х кратного повышения титра Ig G позволяет вынести заключение о неинфицированности и непоказанности антибактериального лечения (табл. 17)
Таблица 16. Состояние после реконвалесценции — “остаточная серология” (сомнительно). Пограничные титры в первой сыворотке.
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
>=10
<50
<50
Сомнительно необходимы проведение ПЦР, культ. посева
Сомнительно
Таблица 17. Состояние после реконвалесценции — “остаточная серология”. Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней.
ТитрIg G
ТитрIg A
Титр Ig M
Заключение о наличии хламидийной инфекции
Антибактериальное лечение
>=100*
<50
<50
Отсутствует
Не показано
* — в случае отсутствия 4-х кратного повышения титра между первой и второй сыворотками. Если это повышение имеется, то отмечается текущая инфекция.
С января 1999 г. на российском рынке появились тест-наборы С. trachomatis Ig G и Ig A pELISA medac. Они используют синтетический пептид из иммунодоминантной области МОМР. С помощью этого высокоспецифичного антигена возможно выделение С. trachomatis — специфических антител с высокой чувствительностью среди общих антихламидийных антител с высокой степенью чувствительности.
Преимущества теста:
-отсутствие ложноположительных результатов, обусловленных межвидовой перекрестной реакцией хламидий;
-отсутствие инфицированного антигенного материала;
-химически точная структура антигена;
-наличие стрипов позволяет экономично использовать тесты;
-пригоден для использования на автоматических открытых системах для ИФА.
ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) производит следующие тест-системы для диагностики хламидиоза методом ИФА:
— ХламиБест-Ig G-стрип для выявления иммуноглобулинов классов G к С. trachomatis и С. psittacci в сыворотке крови ;
— ХламиБест-Trachomatis Ig G-стрип. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке (плазме)крови;
-ХламиБест-Ig M — стрип. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к Chlamydia trachomatis и Chlamydia psrttaci;
— ВектоХлами-антиген-стрип. Тест-система для выявления антигена Chlamydia trachomatis. Хромоген-ОФД.
-ВектоХлами-антиген-стрип. Тест-система для выявления антигена Chlamydia trachomatis.
Имеются реактивы различных фирм для экспресс-диагностики хламидийной инфекции, учет реакции через 10-15 минут визуальный. Однако чувствительность этих методов невысока — 50-60%, они могут быть использованы только для скриннинговых исследований.
Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу
Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (“золотой стандарт”) Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи выявления хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и наоборот.
Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:
1 Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.
2. Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.
3. Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным
препаратам.
4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и туберкулезом).
5. Бесплодие неясного генеза.
6. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.
Культуральныйпосев является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения. При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить “ложноположительные с клинической точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно оценить жизнеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов. В этом случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.
Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду (транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда MEM с добавлен