Реферат: Экспресс диагностика особо опасных инфекций

ВладивостокскийГосударственный Медицинский Университет

Кафедрамикробиологии, вирусологии и иммунологии

РЕФЕРАТ

Экспресс-

Диагностика

Особо Опасных

Инфекций

Выполнил: Новак А.Л.

301 гр., л/ф

Владивосток, 1998.

Содержание

1.<span Times New Roman"">   

Актуальность проблемы……………………………………….3

2.<span Times New Roman"">   

Общие принципыэкспресс-диагностики

     состояний инфекции ииммунитета………………………….4

3.<span Times New Roman"">   

Экспресс-диагностика холеры……………………………….11

4.<span Times New Roman"">   

Экспресс-диагностикатуляремии…………………………..15

5.<span Times New Roman"">   

Экспресс-диагностика чумы…………………………………17

6.<span Times New Roman"">   

Некоторые другие методы……………………………………19

7.<span Times New Roman"">   

Заключение……………………………………………………..22

8.<span Times New Roman"">   

Список использованнойлитературы……………………….23

Актуальность проблемы

Особо опасные инфекции (ООИ)– это инфекции,которые могут возникать среди населения в виде отдельных заболеваний,эпидемий и даже пандемий, чаще  сопровождая ЧС (стихийные бедствия,войны,массовый голод и т.п.),характеризующиеся природнойочаговостью, быстрым распространением и тяжелым течением.

Единого во всем мире мненияо том,какие инфекции следует причислять к ООИ пока нет,отечественные эпидемиологи придерживаются такогоперечня:

1.<span Times New Roman"">    

Чума

2.<span Times New Roman"">    

Туляремия

3.<span Times New Roman"">    

Миелоидоз

4.<span Times New Roman"">    

Геморрагические лихорадки

5.<span Times New Roman"">    

Желтая лихорадка

6.<span Times New Roman"">    

Холера

7.<span Times New Roman"">    

Генерализованная формасибирской язвы

Наиболее вероятное появлениеООИ возможно во время ЧС. Резкое ухудшениесанитарно-гигиенических условий обостряет эпидемическую ситуацию по инфекциям,которые раннее имели эндемических характер,а завезение  инфекции извне прибывающими лицами приводит ктому,что потенциальные источники инфекции оказываются неизолированными и втечение длительного времени имеют многочисленные контакты с окружающими ихлицами.В связи с этим до установления окончательного диагноза заболеваниясоблюдается строгий противоэпидемический режим. При первых признаках илиподозрении на ООИ осуществляется:

·<span Times New Roman"">       

Выявление контактных лиц и их обсервация;

·<span Times New Roman"">       

Дача антибиотиков широкого спектра действия (доксицилин,тетрациклин и др.), т.е.экстренная профилактика;

·<span Times New Roman"">       

Проведение дезинфекционных мероприятий;

·<span Times New Roman"">       

Отбор материала от больных и доставка его в лабораторию длямикробиологического исследования;

·<span Times New Roman"">       

Организация частичной (полной) санобработки конкретных лиц.

В данной работе разбираетсяэтап диагностики ООИ на примере чумы, холеры и туляремии. Еслидиагноз установлен с достаточной достоверностью,можно определить характерпротивоэпидемических мероприятий,установить возможныйисточник инфекции и механизмы его передачи. Именно по этому необходимо иоправдано применение экспресс-методов диагностики ООИ.

Общие принципыэкспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета

Современная иммунологияисключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний и методовбеспредельно раз­нообразны. Они используются практически во всех разделах био­логии,ветеринарии и медицины — от фундаментальных молекулярно-биологическихисследовании до медико-генетического кон­сультирования и множества другихсугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами имедиками.

И, тем не менее, особенноважным в социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает бытьтот старей­ший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которогообеспечивается развитие теории и осуществление прак­тики противоэпидемическойработы—диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. А методыиммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффек­тивногорешения названных проблем и осуществления всех соот­ветствующихпротивоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и посвящены именноэтому разделу прикладной иммунологии, его состоянию и перспективам развития.

Важнейшей предпосылкойэффективности любых противоэпи­демических мероприятий является своевременноепрогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических и соци­ально-экологическихвзаимодействий, которые составляют суще­ство эпидемических процессов.Исключительное разнообразие, свойственное последним и требующее дифференциациипротиво­эпидемических мероприятий, обусловлено не только самобыт­ностью каждойиз существующего множества инфекционных бо­лезней. Очень большое значение имеетв этом отношении фунда­ментальное явление гетерогенности популяций, входящих всостав соответствующих экологических и социально-экологиче­ских системмикроб—жертва. Вариабильность этих весьма сложных биосоциальных факторов иусловий в очень большой мере влияет на специфику того или иного этапасуществования каждого эпидемического процесса. И своевременное распознаваниеэтих особенностей, осуществляемое, как правило, с использованиемиммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию проти­воэпидемическихмероприятий, благодаря которой достигается надлежащее сочетание ихэффективности и оправданности.

Активизация эпидемическихпроцессов определяется, прежде всего,изменением соотношений между двумя основными парамет­рами экологических системмикроб—жертва, а 'именно между бо­лезнетворными потенциями возбудителейсоответствующих инфек­ций и иммунологическим статусом угрожаемых контингентов вце­лом и каждого из их членов в отдельности. Соотношения между этимипараметрами определяют сроки и интенсивность активиза­ции эпидемическихпроцессов, а следовательно объем и характер противоэпидемических мероприятий.Состояние же этих парамет­ров и соотношения между ними характеризуются главнымобра­зом с помощью иммуно-диагностических методов, позволяющих оцениватьсостояния инфицированности и иммунности,как индиви­дуумов, так иколлективов. Вполне понятно, что наибольшую цен­ность имеют экспрессные методыиммунодиагностики.

Иммунологические методыэкспресс-диагностики состояний ин­фекции и иммунитета в некоторых отношенияхпринципиально раз­личны, но во многих других аспектах они являются практическиедиными.

Методы экспресс-диагностикиинфекционных заболеваний до недавнего времени развивались главным образом наоснове клас­сических схем микробиологического анализа, который сводится квыделению в чистой культуре возбудителя и последующей его идентификации побиохимическим, тинкториальным, антигенным и другим характерным свойствам.Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность и практическиисключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническуюпрактику. Длительность микробиологического анализа составляет, как минимум,несколько дней.

Экспресс-индикация — этосвоеобразная раз­ведка большой армии лабораторной диагностики. Она на­ходитсяна переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых методовиндикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение лаборатор­нойпрактики и благодаря этому последняя все время со­вершенствуется.

Основные объективныетребования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний сводятсяк следующему:

1. получение результатованализа в максимально короткие сроки (часы, идеально—минуты);

2. возможность проведения изавершения анализа без выделе­ния искомого микроорганизма в чистой культуре,при использо­вании только нативного материала, в крайнем случае—с привле­чениемэлективных биосред для быстрого накопления возбуди­телей;

3.бесспорно высокаяспецифичность и высокая чувствитель­ность, как предпосылки надлежащейдостоверности анализа;

4. высокая производительность,простота, доступность и воспроизводимость анализов. Эти требования в равноймере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний иммуни­тета.

Предпочтительность использованиятого или иного из суще­ствующих методов экспресс-диагностики зависит от многихкон­кретных условий. Однако наиболее желательным является парал­лельноеиспользование 2—3 методов. Такой подход значительно увеличивает надежностьполучаемого результата.

На ближайшие годы наибо­лееперспективными следующие направления развития экспресс-индикациимикроорганизмов.

1. Энзимоиндикационное направление, связанное с экспресс-индика­циейбиохимических свойств и определением ферментатив­ного спектра микробов.

По-прежнему сохранят своюзначимость исследования по разработке политропных (полисубстратных) питатель­ныхсред. В нашей стране были разработаны оригинальные политропные среды и их комбинации, кото­рые с успехомприменяются в лабораторной практике.

При создании сложныхполикомпонентных питательных систем необходимо исходить из различныхбиохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Для луч­шегопроявления жизнедеятельности и биохимической ак­тивности патогенных и другихмикробов в средах необхо­димо создавать оптимальные условия для их роста и раз­множенияи одновременно вводить ферментируемые суб­страты (углеводы, многоатомныеспирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными индикаторами, которыебыстро бы регистрировали их ферментацию. В результате применения оптимальныхполисубстратных сред произво­дится выделение и накопление чистой культурымикробов с одновременным определением их биохимических призна­ков.

Перспективным следуетрассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых субстрат с инди­каторомотделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. В нашейстране разработаны углеводно-бумажные дис­ки с защитной пленкой (бумажныереагенты для определе­ния дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бу­мажно-индикаторныесистемы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки. Все этипрепараты являются весьма перспективными, они поз­воляют в течение кратчайшегосрока (3—5 ч), используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду,определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.

Автономный препарат —карандаш-фермент, не имею­щий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет безпри­менения питательных сред непосредственно на предметном стекле определятьбиохимические свойства микробов.

Полисубстратная тест-системаи энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20биохимических признаков у микробов. Это новые виды простых «долгоживущих»препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определениябиохимических свойств микробов.

Электрофизический методопределения ферментатив­ной активности микробов включает посев микробной культуры на жидкие питательные среды,содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты,аминокислоты с последующим ферментативным расщепле­нием исследуемых веществ иобразованием различных ио­низированных продуктов распада, обнаруживаемых спе­циальнойэлектронной аппаратурой. Результаты энзимо­индикации регистрируются через 45—60мин с момента посева материала. Метод позволяет обнаружить и иденти­фицироватьконечные продукты распада, то есть конечные мотаболиты с определением ихбиохимической и химичес­кой природы. Безусловно, электрофизический метод заслу­живаетпристального внимания и нуждается в дальнейшем изучении и доработке.

2. Иммунологическое направление, связанное с быстрымопределением как отдельных специфических детерминант, так и с индикацией целыхантигенных групп и комплексов, характеризующих роды, виды и серовары бактерий.К соб­ственно иммунологическому направлению мы относим классическиеиммунологические методы, основанные на использовании естественных реагентов.Реакции преципи­тации в жидкости по Асколи и в геле по Оухтерлоню и Манчини(особенно их микроварианты) сохраняют свое значение как методыэкспресс-индикации патогенных микробов и выявления их антигенов в различныхматериа­лах.

Перспективными являютсярапид-системы для одновре­менной и быстрой индикации различных видов микроорга­низмовв реакциях микроагглютинации, хотя по-прежнему не решены вопросы созданияоптимальных видов и наибо­лее экономичных форм таких систем. Иммунологическиепринципы распознавания антигенов являются весьма тон­кими, специфическими,чувствительными, с большими ин­дикационно-диагностическими возможностями.Комплексирование иммунологических принципов с физическими, хи­мическими инекоторыми другими принципами способство­вало дифференциации иммунологическогонаправления на ряд самостоятельных направлений, которые приводятся ниже.

3. Иммунофизическое направление, использующее раз­личные поприроде, форме и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенови антител, способ­ствующих повышению чувствительности комплексных им­мунологическихметодов.

Реакции пассивнойгемагглютинации и их модифи­кации связаны с использованием эритроцитарныхдиагно­стических препаратов. Эритроцитарную диагностику с успехом применяютсядля ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так иусловно-патоген­ных микроорганизмов (например, возбудителей туляремии,бруцеллеза, сальмонеллеза  и др.) вразличных патоло­гических материалах, получаемых от больных, и в объек­тахвнешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьмачувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие серологическиереак­ции. Они введены в официальные инструкции по экспресс-индикациибактериальных агентов в элементах внешней среды и в материалах, полученных отпораженных людей и животных.

Одновременно продолжаютсяпоиски новых носителей антигенов и антител, которые были бы безантигенными,стабильными, не разрушающимися при длительном хране­нии, а применяемые реакции— простыми по технике по­становки (например, стекольные тесты) и исследования сих помощью — экономичными.

Совершенствуются реакции сприменением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и ан­тител.Положительными свойствами такого рода пре­паратов являются: 1) отсутствиесобственной антигенности; 2) стабильность при длительном хранении; 3)демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на предметномстекле; 4) высокая скорость про­хождения реакции; 5) экономичность.

Кроме того, полезным иоправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В этом отношенииперспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производныеи ряд других веществ, кото­рые могут способствовать повышению чувствительностисерологических реакций.

4. Иммунохимическое направление, связанное с использованиемразнообразных комплексных соединений специ­фических антител или антигенов с химическимивещества­ми. Присоединенные химические вещества придают им но­выефеноменологические способности и свойства, тем са­мым,расширяя возможностиэкспресс-индикации микроб­ных агентов в частности и лабораторного анализавообще.

Большую популярность ипрактическую значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного ана­лиза(прямой, непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используютсякак методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.

Дальнейшее развитие весьмаперспективного иммунохимического направления во многом зависит от химиков,которые должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие всоединения со специфическими антителами и антигенами. В результате могут бытьполу­чены препараты с новыми феноменологическими свойства­ми, позволяющимипроводить экспресс-индикацию микроб­ных культур и отдельных клеток с помощьюшироко рас­пространенных микроскопических устройств (типа МБИ различных марок).

5. Иммуноферментное направление, интенсивно разви­вающееся впоследние годы. Разработаны прямой, непря­мой, антикомплементарный и другиеметоды быстрого об­наружения микробов путем использованияиммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды фермен­тов, а такжеразнообразные виды хромогенных субстратов. Данное направление является весьмаперспективным, раз­витие его может привести в ближайшие годы к появлению новыхметодов экспресс-индикации микроорганизмов.

6. Иммуноэлектрофоретическое направление успешно развивается сконца 50-х годов. Разработаны многочис­ленные методы иммуноэлектрофореза.Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к встречно­муиммуноэлектрофорезу. Применение новых химических красителей, ферментной илирадиоактивной метки позво­лит резко повысить чувствительность методаиммуноэлектропреципитации.

7. Иммунорадиологическое направление связано с ис­пользованиемразнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных срадиоактивными ве­ществами, которые придают им новые феноменологические свойстваи способности, расширяя возможности экспресс-индикационного метода. Весьмаперспективно дальнейшее развитие иммунорадиологического направления, так каконо несомненно приведет к созданию новых, простых ме­тодов экспресс-индикациимикроорганизмов.

8. Микроцитологическое направление быстрогоцитоморфо-логического анализа связано с использованием светлопольной,фазово-контрастной или люминесцентной ми­кроскопии бактериологических мазковыхпрепаратов, обра­ботанных и окрашенных красителями, позволяющими бы­строидентифицировать микроорганизмы по их морфоло­гии и специфическим структурнымэлементам микробной клетки. Исследованию подвергают как нативный (гной,мокрота, моча, СМЖ, различные экссудаты и др.), так и обогащенный (например,центрифугированием, фильтрова­нием и другими методами) патологический материал.

9. Бактериологическое направление связано с ускорен­нымвыделением и накоплением бактериальных популяций патогенных, условно-патогенныхи санитарно-показательных микроорганизмов. Оно основано на использовании оп­тимальныхростовых питательных сред, содержащих необ­ходимые биостимуляторы, дляускоренного получения бак­териальной культуры и частичной их идентификации посовокупности культуральных признаков.

10. Фагодиагностическое направление, которое преду­сматривает, содной стороны, идентификацию микробов с помощью специфических индикаторныхбактериофагов, а с другой,— обнаружение и индикацию специфических фагов впатологическом и другом материалах с помощью инди­каторных микробных культур.

Ускоренная фагодиагностика вряде случаев является необходимым и полезным методом, позволяющим значи­тельносократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в техслучаях, когда другими методами, в виду его изменчивости или загрязненностиматериала, он остается нераспознанным.

11. Биологическое направление, связанное с изучением токсическихи агрессивных свойств патогенных микроорга­низмов. Биологические методыосуществляются на одно­клеточных организмах, на культурах клеток, куриных эм­брионах,а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторныхживотных. Эти методы бо­лее трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.

12. Физико-химическое направление. Это направление связано сиспользованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно сложных поаппаратурному оформ­лению методов. Сюда входят методы изучения бактериаль­ныхпопуляций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостная и др.),спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношениираз­личных антибиотических, химических и лекарственных ве­ществ, а также методытемпературной и кислотной агре­гации, коагуляции микробных суспензий и ихтоксинов.

13. Рецепторное и генетическое направления бы­строй индикациипатогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Методы, основанные наэтих принципах, только начинают развиваться. Так, с помощьюцеллюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстрообнаруживают патогенный стафило­кокк, содержащий белок А, а путем гомологиинеизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислота­миустанавливают вид патогена.

14. Комплексное направление ускоренной идентифика­ции патогенныхи санитарно-показательных микроорганиз­мов, использующее методыэкспресс-индикации, основан­ные на интеграции различных принципов, связано сразра­боткой и созданием индикаторных тест-систем, позволяю­щих в течениекороткого срока и с минимальными затра­тами на анализ определить комплексосновных признаков патогена или санитарно-показательного представителя,достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.

15.Направления, связанные с разработкой новых прин­циповмикробиологического анализа. Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие5—10 лет появления но­вых идей, подходов и принципов в микробиологической нау­кеи смежных с ней областях. Открытие новых видов рецепторной, иммунологической игенетической специфично­сти у микробов позволит создать новые и возможно болеесовершенные методы быстрой идентификации микроорга­низмов.

Основные пути развитияэкспресс-индикации микро­организмов на ближайшие годы:

1) создание иконструирование новых препаратов, спо­собствующих ускорению и удешевлениюисследований, по­вышению эффективности лабораторной диагностики ин­фекций ииндикации патогенных и других микроорганиз­мов. На этом пути предстоит сделатьочень многое, по­скольку общепринятые диагностические препараты в зна­чительнойстепени исчерпали свои потенциальные возмож­ности;

2) разработка новых болеечувствительных, простых методов лабораторного анализа.

3) разработка комплексныхметодов и видов исследо­ваний. Будет продолжаться дальнейшая интеграция мето­дови видов исследований, имеющих разные принципы дей­ствия, лежащие в их основе;

4) создание новых схемисследований. Поскольку ла­бораторная диагностика инфекционных болезней, атакже экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучениемкомплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованиемобычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, тосоздание новых схем исследований с применением но­вых методов являетсяобъективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самогопроцесса разви­тия микробиологического анализа;

5) разработка и созданиеновых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных илаборатор­ных исследований.

6) разработка новоймикроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований;

7) автоматизация икомпьютеризация исследований.

В современных условиях эти вопросыдолжны решаться комплексно.

Таким образом, рассмотренныеосновные направления и пути развития экспресс-индикации микроорганизмов впериод современного научно-технического прогресса есте­ственных наук безусловнополучат дальнейшее ускоренное развитие, а микробиологическая лабораторнаяпрактика обогатится новыми быстрыми методами индикации микро­бов.

Экспресс-диагностика холеры

Холерувызывают два биовара Vibrio cholerae. Один из них,выделенный Кохом в Египте в1883 году,назвали классическим,другой,полученный Ф.Готшлихом на карантинной станции Эль-Тор в СевернойАфрике в 1906 году – V.eltor. оба биоваранеагглютинирующиеся вибрионы (НАГи),галофильныепарагемолитические вибрионы,продуцирующие гемолизин, инехолерные вибрионы-кислотообразователи включены в род Vibrioсемейства Vibrionaceae.

Это острая кишечнаяинфекция,сопровождающаяся резким обезвоживанием и обессоливанием организма.  Источником инфекции является человек –больной или носитель.Механизм передачи фекально-оральный. 

 Возбудители имеютсоматический О- и жгутиковый Н-антигены.О-антиген обладает видовойи типовой специфичностью. По строению О-антигенаразличают долее 40 сероваров. Развивающийся к холереиммунитет носит гуморальный характер.

Материал для исследования:испражнения, рвотныемассы, трупный материал.

Метод массового исследованияна вибриононосительство.Материал беретсянепосредственно из кишечника при помощи стеклянной трубочки диаметром 0,5 см(для детей), 1,5см (для взрослых) и длиной15 см с оплавленными концами (при отсутствии трубочек используют ватные тампонына деревянных палочках).Трубочку немедленнопогружают во флакон,содержащий 100 – 200 мл 1% пептонной воды иагглютинирующую холерную О-сыворотку в разведении до половины ее титра.В одини тот же флакон берут материал от 10 лиц.Флаконы помещают втермостат при 370С.Через 3 – 4 часа холерныевибрионы начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов)падают в виде хлопьев на дно флакона.Исследуя под микроскопомокрашенные мазки и «висячую каплю»,обнаруживаютсклеившихся  и частично свободныхвибрионов.Через 6 часов дается ответ и в случае обнаруженияхолерных вибрионов немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10лиц.Такой метод дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 – 4дня.

Метод иммунодиагностическоймикропленки.Изучение антигенных свойствхолерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатойреакции агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностическихагглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку раз­водятв физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при постановкеагглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При подготовке сы­вороткииспользуется дополнительная посуда, что услож­няет работу бактериолога, а воставшейся разведенной сы­воротке быстро прорастает бактериальная микрофлора иинактивирует ее.

Для изучения антигеннойструктуры холерных вибрио­нов были разработан иммунодиагностический препарат ввиде микропленок разового применения, который обладал  достаточной специфичностью,демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки(ИХМП) в виде полимерной плен­ки с нанесенными высушенными каплями,фиксированны­ми на бумаге, содержат минимальное количество сыворот­ки,пленкообразующий компонент и консервант. Пленко­образующий компонент связывает,склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя,исключает крошение микропленок; консервант предохраня­ет препарат от разрушенияпри длительном хранении.

Концентрация диагностическойсыворотки в ИХМП яв­ляется достаточной, поскольку после эмульгирования в каплефизраствора, антитела содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ходреакции. Тем самым обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается,расход диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования.При этом создаются условия для  быстрогорастворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения реакциинепосредственно на по­лимерной пленке.

Готовые ИХМП хранят в темномсухом месте при 4— 7°С в картонных коробках (срок годности 3 года — срокнаблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения холерныхвибрионов. Для исключения случай­ного заражения окружающих предметов ИХМПпомеща­ют в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплюфизиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сывороткусмешивают с изучаемой куль­турой вибрионов, снятой бактериологической петлей спи­тательной среды. При другом варианте постановки реак­ции ИХМП снимаютскальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют вкапле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культу­рой вибрионов.

При положительной реакциичерез 1—3 мин появляют­ся зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а кап­ляпросветляется. При отрицательной реакции капля оста­ется гомогенно-мутной.

Использованную частьполимерной пленки отрезают, а ос­тавшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в тойже чаш­ке Петри для дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованияхвибрионов и других микроорга­низмов позволяет получить статистическидостоверные ре­зультаты, сэкономить дорогостоящие диагностические сы­воротки,повысить качество и эффективность исследований.

Реакция агглютинациимикрометодом.Впоследнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применениемикрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием спе­циальныхпланшеток и микротитровальных игл .

Реакции агглютинациимикрометодом ставят с холерны­ми агглютинирующими референс-сыворотками вполистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном,предназначенных для иммунологических реакций, используются  мпкротитровальные планшет­ки с объемом лунок0,4 мл и в пробирках параллельно. Предва­рительно планшетки тщательно промывfютпроточной водой, каждую лунку прополаскивали дистиллированной водой и хо­рошопросушивали, затем делали надписи простым каран­дашом.

Во все лунки четырех рядовпипеткой-капельницей из микротитратора Такачи вносят   0,85% раствор хлористо­го натрия (рН 7,2) вобъеме 0,05 мл, затем в первую лунку каждого ряда — того же объемасоответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят ее титрациюмикротитроваль-ной иглой с головкой (объем 0,05 мл), удаляя из последней лункипо 0,05 мл.

После титрации сывороток вовсе лунки, кроме их конт­ролей, вносят 0,05 мл взвеси исследуемой агаровойкультуры. Эту манипуляцию про­водят на подносе.

По окончании титрациипланшет накрывают крышкой и ставят на подносе в термостат при 37° С. После2-часовой экспозиции проводят окончательный учет реакции под стереомикроскопом(МБС-1, МБС-2) в косопроходящем свете. При учете реакции крышку с планшетки неснимают, в случае ее запотевания заменяют другой.

После учета реакциипланшетку и крышку складывают в кювет и заливают 5'% хлорамином так, чтобы вселунки планшетки были заполнены дезраствором.

Исследования показали, чтовсе холерные вибрионы клас­сического и эльтор биоваров агглютинируются холернойви­довой 0-сывороткой в микрообъемах.

Что касаетсяагглютинабельности типоспецифическими сы­воротками, то прослеживается следующаязакономерность:

при постановке с сывороткойИнаба в микрометоде агглюти­нировались 100, а в пробирках—90% штаммов классическогохолерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы био­вара эльтор серовараИнаба агглютинировались в планшет­ках и пробирках соответственно в 95 и 96%случаев. У холер­ных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огавасоотношения в обеих методиках были практически те же.

Интересен факт, что припостановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов,агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микро­методе; впробирках агглютинация   установлена уодного штамма.

Все штаммы вибрионов 040—056сероваров в микромето­де не агглютинировались холерными агглютинирующимисыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировалсявсеми холерными сыворотками.

Большинство изученныхштаммов представителей семейст­ваEnterobacteraceaeтакже не агглютинировалосьхолерными агглютинирующими сыворотками, за исключениемSh.flexneri2503,у которого в пробирках была выявлена агглютина­ция со всеми сыворотками, иштаммаS. typh

еще рефераты
Еще работы по медицине