Реферат: Экспресс диагностика особо опасных инфекций
ВладивостокскийГосударственный Медицинский Университет
Кафедрамикробиологии, вирусологии и иммунологии
РЕФЕРАТ
Экспресс-
Диагностика
Особо Опасных
Инфекций
Выполнил: Новак А.Л.
301 гр., л/ф
Владивосток, 1998.
Содержание
1.<span Times New Roman"">
Актуальность проблемы……………………………………….32.<span Times New Roman"">
Общие принципыэкспресс-диагностикисостояний инфекции ииммунитета………………………….4
3.<span Times New Roman"">
Экспресс-диагностика холеры……………………………….114.<span Times New Roman"">
Экспресс-диагностикатуляремии…………………………..155.<span Times New Roman"">
Экспресс-диагностика чумы…………………………………176.<span Times New Roman"">
Некоторые другие методы……………………………………197.<span Times New Roman"">
Заключение……………………………………………………..228.<span Times New Roman"">
Список использованнойлитературы……………………….23Актуальность проблемы
Особо опасные инфекции (ООИ)– это инфекции,которые могут возникать среди населения в виде отдельных заболеваний,эпидемий и даже пандемий, чаще сопровождая ЧС (стихийные бедствия,войны,массовый голод и т.п.),характеризующиеся природнойочаговостью, быстрым распространением и тяжелым течением.
Единого во всем мире мненияо том,какие инфекции следует причислять к ООИ пока нет,отечественные эпидемиологи придерживаются такогоперечня:
1.<span Times New Roman"">
Чума2.<span Times New Roman"">
Туляремия3.<span Times New Roman"">
Миелоидоз4.<span Times New Roman"">
Геморрагические лихорадки5.<span Times New Roman"">
Желтая лихорадка6.<span Times New Roman"">
Холера7.<span Times New Roman"">
Генерализованная формасибирской язвыНаиболее вероятное появлениеООИ возможно во время ЧС. Резкое ухудшениесанитарно-гигиенических условий обостряет эпидемическую ситуацию по инфекциям,которые раннее имели эндемических характер,а завезение инфекции извне прибывающими лицами приводит ктому,что потенциальные источники инфекции оказываются неизолированными и втечение длительного времени имеют многочисленные контакты с окружающими ихлицами.В связи с этим до установления окончательного диагноза заболеваниясоблюдается строгий противоэпидемический режим. При первых признаках илиподозрении на ООИ осуществляется:
·<span Times New Roman"">
Выявление контактных лиц и их обсервация;·<span Times New Roman"">
Дача антибиотиков широкого спектра действия (доксицилин,тетрациклин и др.), т.е.экстренная профилактика;·<span Times New Roman"">
Проведение дезинфекционных мероприятий;·<span Times New Roman"">
Отбор материала от больных и доставка его в лабораторию длямикробиологического исследования;·<span Times New Roman"">
Организация частичной (полной) санобработки конкретных лиц.В данной работе разбираетсяэтап диагностики ООИ на примере чумы, холеры и туляремии. Еслидиагноз установлен с достаточной достоверностью,можно определить характерпротивоэпидемических мероприятий,установить возможныйисточник инфекции и механизмы его передачи. Именно по этому необходимо иоправдано применение экспресс-методов диагностики ООИ.
Общие принципыэкспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета
Современная иммунологияисключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний и методовбеспредельно разнообразны. Они используются практически во всех разделах биологии,ветеринарии и медицины — от фундаментальных молекулярно-биологическихисследовании до медико-генетического консультирования и множества другихсугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами имедиками.
И, тем не менее, особенноважным в социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает бытьтот старейший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которогообеспечивается развитие теории и осуществление практики противоэпидемическойработы—диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. А методыиммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективногорешения названных проблем и осуществления всех соответствующихпротивоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и посвящены именноэтому разделу прикладной иммунологии, его состоянию и перспективам развития.
Важнейшей предпосылкойэффективности любых противоэпидемических мероприятий является своевременноепрогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических и социально-экологическихвзаимодействий, которые составляют существо эпидемических процессов.Исключительное разнообразие, свойственное последним и требующее дифференциациипротивоэпидемических мероприятий, обусловлено не только самобытностью каждойиз существующего множества инфекционных болезней. Очень большое значение имеетв этом отношении фундаментальное явление гетерогенности популяций, входящих всостав соответствующих экологических и социально-экологических системмикроб—жертва. Вариабильность этих весьма сложных биосоциальных факторов иусловий в очень большой мере влияет на специфику того или иного этапасуществования каждого эпидемического процесса. И своевременное распознаваниеэтих особенностей, осуществляемое, как правило, с использованиемиммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию противоэпидемическихмероприятий, благодаря которой достигается надлежащее сочетание ихэффективности и оправданности.
Активизация эпидемическихпроцессов определяется, прежде всего,изменением соотношений между двумя основными параметрами экологических системмикроб—жертва, а 'именно между болезнетворными потенциями возбудителейсоответствующих инфекций и иммунологическим статусом угрожаемых контингентов вцелом и каждого из их членов в отдельности. Соотношения между этимипараметрами определяют сроки и интенсивность активизации эпидемическихпроцессов, а следовательно объем и характер противоэпидемических мероприятий.Состояние же этих параметров и соотношения между ними характеризуются главнымобразом с помощью иммуно-диагностических методов, позволяющих оцениватьсостояния инфицированности и иммунности,как индивидуумов, так иколлективов. Вполне понятно, что наибольшую ценность имеют экспрессные методыиммунодиагностики.
Иммунологические методыэкспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета в некоторых отношенияхпринципиально различны, но во многих других аспектах они являются практическиедиными.
Методы экспресс-диагностикиинфекционных заболеваний до недавнего времени развивались главным образом наоснове классических схем микробиологического анализа, который сводится квыделению в чистой культуре возбудителя и последующей его идентификации побиохимическим, тинкториальным, антигенным и другим характерным свойствам.Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность и практическиисключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническуюпрактику. Длительность микробиологического анализа составляет, как минимум,несколько дней.
Экспресс-индикация — этосвоеобразная разведка большой армии лабораторной диагностики. Она находитсяна переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых методовиндикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение лабораторнойпрактики и благодаря этому последняя все время совершенствуется.
Основные объективныетребования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний сводятсяк следующему:
1. получение результатованализа в максимально короткие сроки (часы, идеально—минуты);
2. возможность проведения изавершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре,при использовании только нативного материала, в крайнем случае—с привлечениемэлективных биосред для быстрого накопления возбудителей;
3.бесспорно высокаяспецифичность и высокая чувствительность, как предпосылки надлежащейдостоверности анализа;
4. высокая производительность,простота, доступность и воспроизводимость анализов. Эти требования в равноймере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний иммунитета.
Предпочтительность использованиятого или иного из существующих методов экспресс-диагностики зависит от многихконкретных условий. Однако наиболее желательным является параллельноеиспользование 2—3 методов. Такой подход значительно увеличивает надежностьполучаемого результата.
На ближайшие годы наиболееперспективными следующие направления развития экспресс-индикациимикроорганизмов.
1. Энзимоиндикационное направление, связанное с экспресс-индикациейбиохимических свойств и определением ферментативного спектра микробов.
По-прежнему сохранят своюзначимость исследования по разработке политропных (полисубстратных) питательныхсред. В нашей стране были разработаны оригинальные политропные среды и их комбинации, которые с успехомприменяются в лабораторной практике.
При создании сложныхполикомпонентных питательных систем необходимо исходить из различныхбиохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Для лучшегопроявления жизнедеятельности и биохимической активности патогенных и другихмикробов в средах необходимо создавать оптимальные условия для их роста и размноженияи одновременно вводить ферментируемые субстраты (углеводы, многоатомныеспирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными индикаторами, которыебыстро бы регистрировали их ферментацию. В результате применения оптимальныхполисубстратных сред производится выделение и накопление чистой культурымикробов с одновременным определением их биохимических признаков.
Перспективным следуетрассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых субстрат с индикаторомотделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. В нашейстране разработаны углеводно-бумажные диски с защитной пленкой (бумажныереагенты для определения дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бумажно-индикаторныесистемы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки. Все этипрепараты являются весьма перспективными, они позволяют в течение кратчайшегосрока (3—5 ч), используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду,определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.
Автономный препарат —карандаш-фермент, не имеющий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет безприменения питательных сред непосредственно на предметном стекле определятьбиохимические свойства микробов.
Полисубстратная тест-системаи энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20биохимических признаков у микробов. Это новые виды простых «долгоживущих»препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определениябиохимических свойств микробов.
Электрофизический методопределения ферментативной активности микробов включает посев микробной культуры на жидкие питательные среды,содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты,аминокислоты с последующим ферментативным расщеплением исследуемых веществ иобразованием различных ионизированных продуктов распада, обнаруживаемых специальнойэлектронной аппаратурой. Результаты энзимоиндикации регистрируются через 45—60мин с момента посева материала. Метод позволяет обнаружить и идентифицироватьконечные продукты распада, то есть конечные мотаболиты с определением ихбиохимической и химической природы. Безусловно, электрофизический метод заслуживаетпристального внимания и нуждается в дальнейшем изучении и доработке.
2. Иммунологическое направление, связанное с быстрымопределением как отдельных специфических детерминант, так и с индикацией целыхантигенных групп и комплексов, характеризующих роды, виды и серовары бактерий.К собственно иммунологическому направлению мы относим классическиеиммунологические методы, основанные на использовании естественных реагентов.Реакции преципитации в жидкости по Асколи и в геле по Оухтерлоню и Манчини(особенно их микроварианты) сохраняют свое значение как методыэкспресс-индикации патогенных микробов и выявления их антигенов в различныхматериалах.
Перспективными являютсярапид-системы для одновременной и быстрой индикации различных видов микроорганизмовв реакциях микроагглютинации, хотя по-прежнему не решены вопросы созданияоптимальных видов и наиболее экономичных форм таких систем. Иммунологическиепринципы распознавания антигенов являются весьма тонкими, специфическими,чувствительными, с большими индикационно-диагностическими возможностями.Комплексирование иммунологических принципов с физическими, химическими инекоторыми другими принципами способствовало дифференциации иммунологическогонаправления на ряд самостоятельных направлений, которые приводятся ниже.
3. Иммунофизическое направление, использующее различные поприроде, форме и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенови антител, способствующих повышению чувствительности комплексных иммунологическихметодов.
Реакции пассивнойгемагглютинации и их модификации связаны с использованием эритроцитарныхдиагностических препаратов. Эритроцитарную диагностику с успехом применяютсядля ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так иусловно-патогенных микроорганизмов (например, возбудителей туляремии,бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) вразличных патологических материалах, получаемых от больных, и в объектахвнешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьмачувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие серологическиереакции. Они введены в официальные инструкции по экспресс-индикациибактериальных агентов в элементах внешней среды и в материалах, полученных отпораженных людей и животных.
Одновременно продолжаютсяпоиски новых носителей антигенов и антител, которые были бы безантигенными,стабильными, не разрушающимися при длительном хранении, а применяемые реакции— простыми по технике постановки (например, стекольные тесты) и исследования сих помощью — экономичными.
Совершенствуются реакции сприменением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и антител.Положительными свойствами такого рода препаратов являются: 1) отсутствиесобственной антигенности; 2) стабильность при длительном хранении; 3)демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на предметномстекле; 4) высокая скорость прохождения реакции; 5) экономичность.
Кроме того, полезным иоправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В этом отношенииперспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производныеи ряд других веществ, которые могут способствовать повышению чувствительностисерологических реакций.
4. Иммунохимическое направление, связанное с использованиемразнообразных комплексных соединений специфических антител или антигенов с химическимивеществами. Присоединенные химические вещества придают им новыефеноменологические способности и свойства, тем самым,расширяя возможностиэкспресс-индикации микробных агентов в частности и лабораторного анализавообще.
Большую популярность ипрактическую значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного анализа(прямой, непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используютсякак методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.
Дальнейшее развитие весьмаперспективного иммунохимического направления во многом зависит от химиков,которые должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие всоединения со специфическими антителами и антигенами. В результате могут бытьполучены препараты с новыми феноменологическими свойствами, позволяющимипроводить экспресс-индикацию микробных культур и отдельных клеток с помощьюшироко распространенных микроскопических устройств (типа МБИ различных марок).
5. Иммуноферментное направление, интенсивно развивающееся впоследние годы. Разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другиеметоды быстрого обнаружения микробов путем использованияиммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды ферментов, а такжеразнообразные виды хромогенных субстратов. Данное направление является весьмаперспективным, развитие его может привести в ближайшие годы к появлению новыхметодов экспресс-индикации микроорганизмов.
6. Иммуноэлектрофоретическое направление успешно развивается сконца 50-х годов. Разработаны многочисленные методы иммуноэлектрофореза.Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к встречномуиммуноэлектрофорезу. Применение новых химических красителей, ферментной илирадиоактивной метки позволит резко повысить чувствительность методаиммуноэлектропреципитации.
7. Иммунорадиологическое направление связано с использованиемразнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных срадиоактивными веществами, которые придают им новые феноменологические свойстваи способности, расширяя возможности экспресс-индикационного метода. Весьмаперспективно дальнейшее развитие иммунорадиологического направления, так каконо несомненно приведет к созданию новых, простых методов экспресс-индикациимикроорганизмов.
8. Микроцитологическое направление быстрогоцитоморфо-логического анализа связано с использованием светлопольной,фазово-контрастной или люминесцентной микроскопии бактериологических мазковыхпрепаратов, обработанных и окрашенных красителями, позволяющими быстроидентифицировать микроорганизмы по их морфологии и специфическим структурнымэлементам микробной клетки. Исследованию подвергают как нативный (гной,мокрота, моча, СМЖ, различные экссудаты и др.), так и обогащенный (например,центрифугированием, фильтрованием и другими методами) патологический материал.
9. Бактериологическое направление связано с ускореннымвыделением и накоплением бактериальных популяций патогенных, условно-патогенныхи санитарно-показательных микроорганизмов. Оно основано на использовании оптимальныхростовых питательных сред, содержащих необходимые биостимуляторы, дляускоренного получения бактериальной культуры и частичной их идентификации посовокупности культуральных признаков.
10. Фагодиагностическое направление, которое предусматривает, содной стороны, идентификацию микробов с помощью специфических индикаторныхбактериофагов, а с другой,— обнаружение и индикацию специфических фагов впатологическом и другом материалах с помощью индикаторных микробных культур.
Ускоренная фагодиагностика вряде случаев является необходимым и полезным методом, позволяющим значительносократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в техслучаях, когда другими методами, в виду его изменчивости или загрязненностиматериала, он остается нераспознанным.
11. Биологическое направление, связанное с изучением токсическихи агрессивных свойств патогенных микроорганизмов. Биологические методыосуществляются на одноклеточных организмах, на культурах клеток, куриных эмбрионах,а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторныхживотных. Эти методы более трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.
12. Физико-химическое направление. Это направление связано сиспользованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно сложных поаппаратурному оформлению методов. Сюда входят методы изучения бактериальныхпопуляций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостная и др.),спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношенииразличных антибиотических, химических и лекарственных веществ, а также методытемпературной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий и ихтоксинов.
13. Рецепторное и генетическое направления быстрой индикациипатогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Методы, основанные наэтих принципах, только начинают развиваться. Так, с помощьюцеллюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстрообнаруживают патогенный стафилококк, содержащий белок А, а путем гомологиинеизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислотамиустанавливают вид патогена.
14. Комплексное направление ускоренной идентификации патогенныхи санитарно-показательных микроорганизмов, использующее методыэкспресс-индикации, основанные на интеграции различных принципов, связано сразработкой и созданием индикаторных тест-систем, позволяющих в течениекороткого срока и с минимальными затратами на анализ определить комплексосновных признаков патогена или санитарно-показательного представителя,достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.
15.Направления, связанные с разработкой новых принциповмикробиологического анализа. Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие5—10 лет появления новых идей, подходов и принципов в микробиологической наукеи смежных с ней областях. Открытие новых видов рецепторной, иммунологической игенетической специфичности у микробов позволит создать новые и возможно болеесовершенные методы быстрой идентификации микроорганизмов.
Основные пути развитияэкспресс-индикации микроорганизмов на ближайшие годы:
1) создание иконструирование новых препаратов, способствующих ускорению и удешевлениюисследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций ииндикации патогенных и других микроорганизмов. На этом пути предстоит сделатьочень многое, поскольку общепринятые диагностические препараты в значительнойстепени исчерпали свои потенциальные возможности;
2) разработка новых болеечувствительных, простых методов лабораторного анализа.
3) разработка комплексныхметодов и видов исследований. Будет продолжаться дальнейшая интеграция методови видов исследований, имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе;
4) создание новых схемисследований. Поскольку лабораторная диагностика инфекционных болезней, атакже экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучениемкомплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованиемобычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, тосоздание новых схем исследований с применением новых методов являетсяобъективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самогопроцесса развития микробиологического анализа;
5) разработка и созданиеновых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных илабораторных исследований.
6) разработка новоймикроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований;
7) автоматизация икомпьютеризация исследований.
В современных условиях эти вопросыдолжны решаться комплексно.
Таким образом, рассмотренныеосновные направления и пути развития экспресс-индикации микроорганизмов впериод современного научно-технического прогресса естественных наук безусловнополучат дальнейшее ускоренное развитие, а микробиологическая лабораторнаяпрактика обогатится новыми быстрыми методами индикации микробов.
Экспресс-диагностика холеры
Холерувызывают два биовара Vibrio cholerae. Один из них,выделенный Кохом в Египте в1883 году,назвали классическим,другой,полученный Ф.Готшлихом на карантинной станции Эль-Тор в СевернойАфрике в 1906 году – V.eltor. оба биоваранеагглютинирующиеся вибрионы (НАГи),галофильныепарагемолитические вибрионы,продуцирующие гемолизин, инехолерные вибрионы-кислотообразователи включены в род Vibrioсемейства Vibrionaceae.
Это острая кишечнаяинфекция,сопровождающаяся резким обезвоживанием и обессоливанием организма. Источником инфекции является человек –больной или носитель.Механизм передачи фекально-оральный.
Возбудители имеютсоматический О- и жгутиковый Н-антигены.О-антиген обладает видовойи типовой специфичностью. По строению О-антигенаразличают долее 40 сероваров. Развивающийся к холереиммунитет носит гуморальный характер.
Материал для исследования:испражнения, рвотныемассы, трупный материал.
Метод массового исследованияна вибриононосительство.Материал беретсянепосредственно из кишечника при помощи стеклянной трубочки диаметром 0,5 см(для детей), 1,5см (для взрослых) и длиной15 см с оплавленными концами (при отсутствии трубочек используют ватные тампонына деревянных палочках).Трубочку немедленнопогружают во флакон,содержащий 100 – 200 мл 1% пептонной воды иагглютинирующую холерную О-сыворотку в разведении до половины ее титра.В одини тот же флакон берут материал от 10 лиц.Флаконы помещают втермостат при 370С.Через 3 – 4 часа холерныевибрионы начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов)падают в виде хлопьев на дно флакона.Исследуя под микроскопомокрашенные мазки и «висячую каплю»,обнаруживаютсклеившихся и частично свободныхвибрионов.Через 6 часов дается ответ и в случае обнаруженияхолерных вибрионов немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10лиц.Такой метод дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 – 4дня.
Метод иммунодиагностическоймикропленки.Изучение антигенных свойствхолерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатойреакции агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностическихагглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку разводятв физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при постановкеагглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При подготовке сывороткииспользуется дополнительная посуда, что усложняет работу бактериолога, а воставшейся разведенной сыворотке быстро прорастает бактериальная микрофлора иинактивирует ее.
Для изучения антигеннойструктуры холерных вибрионов были разработан иммунодиагностический препарат ввиде микропленок разового применения, который обладал достаточной специфичностью,демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки(ИХМП) в виде полимерной пленки с нанесенными высушенными каплями,фиксированными на бумаге, содержат минимальное количество сыворотки,пленкообразующий компонент и консервант. Пленкообразующий компонент связывает,склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя,исключает крошение микропленок; консервант предохраняет препарат от разрушенияпри длительном хранении.
Концентрация диагностическойсыворотки в ИХМП является достаточной, поскольку после эмульгирования в каплефизраствора, антитела содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ходреакции. Тем самым обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается,расход диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования.При этом создаются условия для быстрогорастворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения реакциинепосредственно на полимерной пленке.
Готовые ИХМП хранят в темномсухом месте при 4— 7°С в картонных коробках (срок годности 3 года — срокнаблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения холерныхвибрионов. Для исключения случайного заражения окружающих предметов ИХМПпомещают в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплюфизиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сывороткусмешивают с изучаемой культурой вибрионов, снятой бактериологической петлей спитательной среды. При другом варианте постановки реакции ИХМП снимаютскальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют вкапле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культурой вибрионов.
При положительной реакциичерез 1—3 мин появляются зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а капляпросветляется. При отрицательной реакции капля остается гомогенно-мутной.
Использованную частьполимерной пленки отрезают, а оставшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в тойже чашке Петри для дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованияхвибрионов и других микроорганизмов позволяет получить статистическидостоверные результаты, сэкономить дорогостоящие диагностические сыворотки,повысить качество и эффективность исследований.
Реакция агглютинациимикрометодом.Впоследнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применениемикрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием специальныхпланшеток и микротитровальных игл .
Реакции агглютинациимикрометодом ставят с холерными агглютинирующими референс-сыворотками вполистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном,предназначенных для иммунологических реакций, используются мпкротитровальные планшетки с объемом лунок0,4 мл и в пробирках параллельно. Предварительно планшетки тщательно промывfютпроточной водой, каждую лунку прополаскивали дистиллированной водой и хорошопросушивали, затем делали надписи простым карандашом.
Во все лунки четырех рядовпипеткой-капельницей из микротитратора Такачи вносят 0,85% раствор хлористого натрия (рН 7,2) вобъеме 0,05 мл, затем в первую лунку каждого ряда — того же объемасоответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят ее титрациюмикротитроваль-ной иглой с головкой (объем 0,05 мл), удаляя из последней лункипо 0,05 мл.
После титрации сывороток вовсе лунки, кроме их контролей, вносят 0,05 мл взвеси исследуемой агаровойкультуры. Эту манипуляцию проводят на подносе.
По окончании титрациипланшет накрывают крышкой и ставят на подносе в термостат при 37° С. После2-часовой экспозиции проводят окончательный учет реакции под стереомикроскопом(МБС-1, МБС-2) в косопроходящем свете. При учете реакции крышку с планшетки неснимают, в случае ее запотевания заменяют другой.
После учета реакциипланшетку и крышку складывают в кювет и заливают 5'% хлорамином так, чтобы вселунки планшетки были заполнены дезраствором.
Исследования показали, чтовсе холерные вибрионы классического и эльтор биоваров агглютинируются холернойвидовой 0-сывороткой в микрообъемах.
Что касаетсяагглютинабельности типоспецифическими сыворотками, то прослеживается следующаязакономерность:
при постановке с сывороткойИнаба в микрометоде агглютинировались 100, а в пробирках—90% штаммов классическогохолерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы биовара эльтор серовараИнаба агглютинировались в планшетках и пробирках соответственно в 95 и 96%случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огавасоотношения в обеих методиках были практически те же.
Интересен факт, что припостановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов,агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микрометоде; впробирках агглютинация установлена уодного штамма.
Все штаммы вибрионов 040—056сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирующимисыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировалсявсеми холерными сыворотками.
Большинство изученныхштаммов представителей семействаEnterobacteraceaeтакже не агглютинировалосьхолерными агглютинирующими сыворотками, за исключениемSh.flexneri2503,у которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми сыворотками, иштаммаS. typh