Реферат: Влияние производных адамантана с различными характерами заместителей на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека

Введение

В медицине всё ещё стоит вопрос об эффективности лечения патологийсистемы свёртывания крови, в частности таких нарушений, как тромбоцитоз(патологическое увеличение числа тромбоцитов) и тромбоцитопения (уменьшениечисла тромбоцитов в крови). Повышенная способность тромбоцитов к агрегациинаблюдается при ряде заболеваний: ишемической болезни сердца, атеросклерозе,диабетических ангиопатиях и др., что значительно осложняет течение болезни [6,43]. Путём направленного фармакологического воздействия можно снижать патологическивозникшую гиперагрегацию тромбоцитов, или наоборот, повышать их способность кагрегации.

Вданной работе исследовано влияние производных адамантана с различнымихарактерами заместителей на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека. Ранее было показано, что амиды N-[(адамантоил-1)-фенил]-антраниловойкислоты проявляли выраженное ингибирование серотонинового отёка,предполагалось, что это явление вызвано блокированием серотониновых рецепторовсосудистой стенки этими амидами [11].

Научнаяновизна работы: впервые исследованы вновь синтезированные производныеадамантана, способные усиливать или снижать эффект известных индукторовагрегации тромбоцитов посредством модуляции функционирования соответствующихтромбоцитарных рецепторов.

Результатыработы имеют практическое значение – исследованные соединения после болеедетального изучения механизма их действия могут быть использованы в качествемедицинских препаратов.

По теме дипломной работыопубликовано три статьи (две из них приняты в печать). Результатыпредставлялись на 56 и 57 научных студенческих конференциях.

Цельработы: изучить механизмы влияния вновь синтезированных производных адамантанана индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

Задачи исследования:

1. Выявить средиисследуемых соединений синергистов (илиагонистов) и антагонистов серотонина;

2. Выяснитьмеханизмы влияния этих соединений на индуцируемую агрегацию тромбоцитовчеловека;

3. Проверить наличие свойствагонистов агрегирующих тромбоциты веществ у всех исследуемых соединений;

4. Выявить синергистов и антагонистовсеротонина;

5. Выявить синергистов и антагонистовАДФ;

6. Выявить синергистов и антагонистов адреналина.

Глава 1. Обзор литературы

 

1.1. Механизмы агрегации тромбоцитов человека

Тромбоциты – плоские безъядерные клетки крови неправильной округлойформы, образующиеся из мегакариоцитов костного мозга путём отщепления от нихучастков цитоплазмы. Образование тромбоцитов регулируется гликопротеиновымгормоном тромбопоэтином. Нормальные тромбоциты – клетки диаметром 1-5 мкм,толщиной 0,5-0,75 мкм. Содержание тромбоцитов в крови здорового человекасоставляет 180-320 тыс. в 1 мл. Молодые тромбоциты проходят период созревания –восемь суток, зрелые циркулируют в кровотоке от пяти до 11 суток, с последующимразрушением в печени и селезёнке. Число тромбоцитов в крови относительнопостоянно, но ночью оно снижается, а  возрастает при пищеварении, тяжёлоймышечной работе, беременности [31].

На мембране тромбоцитов адсорбируются факторы свёртывающей системы крови.Тромбоциты способны выделять из фосфолипидов своих клеточных мембранарахидоновую кислоту и превращать её в тромбоксаны (при участиитромбоксансинтетазы), которые повышают агрегационную активность тромбоцитов.Примыкающая к оболочке тромбоцита область неструктурированной цитоплазмы –гиаломер. В гиаломере после активации тромбоцита при электронной микроскопиистановятся видны микрофиламенты из актина, миозина и тропомиозина, составляющиевместе с микротрубочками цитоскелет клетки, который определяет её форму и способностьперемещать органеллы, прикрепляться к поверхностям и образовывать псевдоподии[42, 48]. Актиновые филаменты имеют диаметр 3-5 нм, а миозиновые 6-10 нм.Микрофиламенты контактируют между собой, плазматической мембраной и мембранамигранул [85]. Микротрубочки в основном состоят из тубулина, их диаметр 25-30 нм.Концентрическая система из 5-30 микротрубочек тромбоцитов образуетпериферический пучок под плазматической мембраной вдоль экватора клетки. Такжеприсутствуют и другие немембранные структуры – гранулы гликогена.

В тромбоцитах различают две системы мембран: плотную тубулярную систему(ПТС) и систему открытых каналов. ПТС – система узких трубочек диаметром 50 нм,подобная ЭПР скелетной мышцы. Эти трубочки не контактируют с системой открытыхканалов, органеллами и плазматической мембраной, расположены и по экваторуклетки и среди органелл [36, 86]. Система открытых каналов сообщается сгранулами тромбоцитов и с плазматической мембраной, за счёт чего иосуществляется секреция тромбоцитами специфических соединений в процессереакции высвобождения. Поверхность тромбоцитов может увеличиваться за счётсистемы открытых каналов [36, 82, 86]. Центральная часть тромбоцитов(грануломер) содержит органеллы и множество гранул различной структуры, формы ивеличины («электроноплотные» гранулы, α-гранулы, лизосомы). Вэлектроноплотных гранулах содержатся АДФ, АТФ, ГТФ, ГДФ, неорганический фосфат,серотонин, Са2+; в α-гранулах – трансформирующий ростовойфактор, β-тромбоглобулин, антигепарин (фактор пластинок 4), фибронектин,альбумин, фибриноген, проакцелерин (фактор V), антигенфактора Виллебранда (фактор VIII), калликреин, α2-антиплазмин,тромбоспондин, гистамин; в лизосомах –  кислые гидролазы(β-гексозаминидаза, β-галактозидаза, β-глюкуронидаза,β-арабинозидаза, β-глицерофосфатаза, арилсульфотаза) [22, 42].  Втромбоцитах имеются гликолитические ферменты и ферменты пентозофосфатногоцикла, цикла лимонной кислоты и дыхательной цепи, АТФаза [42]. 

Важнейшим свойством тромбоцитов является способность к агрегации, в процессекоторой в них синтезируется, а затем секретируется ряд белков и биологическиактивных веществ, стимулирующих свёртывание крови (гемостаз). Тромбоцитыпринимают участие и в защите организма от чужеродных агентов. Они обладаютфагоцитарной активностью, содержат IgG, являются источником лизоцима иβ-лизинов, способных разрушать мембрану некоторых бактерий.

Гемостаз осуществляется в 4 фазы: сокращение сосуда, образованиетромбоцитарной пробки, формирование красного тромба и его ретракция, полное иличастичное растворение тромба [29]. Различают внешний путь свёртывания (в местеповреждения сосудов, индуцируется коллагеном) и внутренний путь свёртывания (вобласти замедленного кровотока на патологически изменённой поверхностисосудистой стенки, индуцируется факторами плазмы), они различаются начальнымиэтапами, объединяясь на стадии активации фактора Х. В настоящее время известномного факторов свёртывания крови, отсутствие любого из которых может привести кнарушению процесса коагуляции. В основном они представляют собойпротеолитические ферменты (факторы XII, XI, X, IX, VII,II и калликреин – сериновые протеазы), присутствующие в крови в неактивнойформе в виде проферментов. В процессе свёртывания они активируют друг друга вкаскадной последовательности реакций. Активированные факторы обозначаютсяприбавлением буквы «а», например, Xа. (рис. 1)

/>

Рис. 1. Схема свёртывания крови и фибринолиза. ФП 3 – тромбоцитарныйфактор 3 (по Циммерману, 1996)

Сразу после травмы наблюдается первичный спазм кровеносных сосудов,благодаря чему кровотечение в первые секунды может не возникнуть или носитограниченный характер. Первичный спазм сосудов обусловлен выбросом в кровь вответ на болевое раздражение адреналина и норадреналина и длится 10-15 с.Повреждение сосудов сопровождается немедленной активацией тромбоцитов вследствиепоявления высоких концентраций АДФ (из травмированных клеток сосудов), а так жеобнажением субэндотелия, коллагеновых и фибриллярных структур [57]. Вдальнейшем наступает вторичный спазм, обусловленный активацией тромбоцитов ивыбросом в кровь сосудосуживающих агентов – серотонина, тромбоксана А2,адреналина и др. (реакция высвобождения).

Просвет повреждённых сосудов уменьшается и перекрывается массойтромбоцитов, прилипших к коллагеновым волокнам. Тромбоксан А2 и АДФ,выделяющиеся при разрушении внутриклеточной структуры активированныхтромбоцитов, вызывают присоединение новых тромбоцитов. АДФ также можетвысвобождаться из разрушенных эритроцитов [32], и  способствует превращениюкровяных пластинок в диски, а также вызывает секрецию тромбоцитарных белков изэлектроноплотных и α-гранул [68]. Тромбоциты распластываются, у нихпоявляется до 10 «отростков», которые могут в 5-10 раз превышать диаметр самойклетки [2, 34]. Организованное кольцо микротрубочек распадается, изменяетсяраспределение микрофиламентов и микротрубочек, микротрубочки могут образовыватьклубочки [36, 54].

На нескольких из этапов гемокоагуляции существуют перекрёстныевзаимодействия между внешней и внутренней системами свёртывания, благодаря чемуобеспечиваются «альтернативные» пути для процессов коагуляции [42, 65].

Агрегация тромбоцитов наступает одновременно с их адгезией, это активныйпроцесс, протекающий с затратой энергии. Адгезия тромбоцитов к волокнамсоединительной ткани по краям раны обусловлена олигомерным гликопротеином,содержащимся в субэндотелии и кровяных пластинках, – фактором Виллебранда. Онобразует мостики между субэндотелиальными структурами и специфическимирецепторами (гликопротеин Ib) на мембране тромбоцитов [8].  Фибриноген – белок,содержащийся в плазме и тромбоцитах, тоже способный образовывать междутромбоцитами связующие мостики, что приводит к появлению сети фибрина итромбоцитарной пробки. Частичный протеолиз молекулы фибриногена наступает поддействием тромбина. Для образования ковалентных связей необходим фибринстабилизирующийфактор XIII (трансглутаминаза), активируемая тромбином вприсутствии ионов кальция. Трёхмерная сеть волокон фибрина удерживает клеткикрови, формируется красный тромб (рис. 1). Благодаря контрактильному белкутромбостенину тромбоциты подтягиваются друг к другу, тромбоцитарная пробкасокращается и уплотняется, т. е. наступает её ретракция [49]. Сгустокстановится более плотным и стягивает края раны, что облегчает её зарастаниеклетками соединительной ткани. В норме остановка кровотечения из мелких сосудовзанимает от двух до четырёх минут [34].

Таким образом, при повреждении кровеносного сосуда в крови появляютсявещества, инициирующие процесс агрегации тромбоцитов. Характер действия этихвеществ разный, так, слабыми агрегирующими агентами являются АДФ, серотонин,адреналин, вазопрессин, – они действуют первыми, лишь запуская каскадпоследующих реакций. Более быстро агрегация происходит под действием коллагена,тромбина, ионофора А23187. Агрегация тромбоцитов может носить обратимыйхарактер (вслед за агрегацией наступает дезагрегация, распад агрегатов), чтозависит от недостаточной дозы агрегирующего агента или от наличия в кровипростациклина PGI2,синтезирующегося в эндотелии сосудов, который ингибирует агрегацию тромбоцитов[5]. Травма сосуда всегда сопровождается образованием сразу несколькихиндукторов агрегации, способных инициировать агрегацию тромбоцитов разнымипутями, и их концентрация достаточно высока, поэтому дезагрегация, как правило,не случается.

Биохимические механизмы активации тромбоцитов с их последующей агрегациейразличны, что обусловлено различным характером инициаторов агрегации. Однако,все известные агреганты так или иначе способствуют увеличению концентрации Са2+в цитоплазме тромбоцита.

Общее содержание Са2+ в тромбоцитах составляет около 60нмоль/109 клеток. Четверть этого кальция связана с мембранамитромбоцитов, но значительное его количество содержится в тубулярной системе иплотных гранулах. Концентрация свободных ионов Са2+ в цитоплазметромбоцитов (10-7 моль/л)<sup/>почти в 1000 раз ниже, чем вплазме (10-3 моль/л). Такая разница в концентрации этих ионов по обестороны плазматической мембраны поддерживается мембранными Са2+-АТФазами,которые используют энергию гидролиза АТФ для откачивания Са2+ изцитоплазмы в окружённые мембранами клеточные органеллы, а так жеаденилатциклазами и фосфодиэстеразами, контролирующими уровень цАМФ.Активированная аденилатциклаза катализирует образование цАМФ из АТФ,фосфодиэстераза осуществляет гидролиз цАМФ до 5-АМФ. Аденилатциклаза тромбоцитовлокализована на внутренней стороне плазматической мембраны, на мембранахплотной тубулярной системы и системы открытых каналов. Фосфодиэстеразанаходится в цитоплазме. Активация аденилатциклазы происходит посредствомвзаимодействия простагландинов Е1, I2 и D2 со специфическими рецепторамимембран, сопряжёнными с ГТФ-связывающими белками (G-белки). Дляэтих рецепторов цАМФ служит внутриклеточным медиатором. Активированныерецепторы действуют на G-белки, которые стимулируют аденилатциклазу,образуется цАМФ, активируются цАМФ-зависимые ферменты (протеинкиназы),катализирующие фосфорилирование небольшой группы тромбоцитарных белков [36].

Адреналин, связываясь соспецифическими рецепторами мембраны тромбоцитов, посредством G-белков стимулирует образованиетромбоксана А2 [36]. Предполагается, что ускоряющий агрегациютромбоцитов эффект адреналина связан с модуляцией мембран при еговзаимодействии с α-адренорецепторами и изменением её проницаемости к ионамСа2+ [73, 79]. Показано, что антагонисты α2-адренорецепторовспособны блокировать агрегацию, а агонисты усиливают её, посколькуактивированные Gi-белкиингибируют аденилатциклазу [10, 59]. Через β-адренорецепторы происходитзамедление агрегации тромбоцитов. Стимуляция β-адренорецепторовпосредством Gs-белков приводит к активацииаденилатциклазы, т. е. катехоламины способны регулировать активностьтромбоцитов, влияя на уровень цАМФ в клетке. Адреналин вызывает агрегациютромбоцитов без изменения их формы [53]. Адреналин-индуцированное изменениеоптической плотности проб наблюдается через 30 с после его добавления [36].

Активация тромбоцитов тромбином, коллагеном, фактором активациитромбоцитов (ФАТ) и некоторыми другими агрегантами происходит через образованиеиз фосфолипидов плазматической мембраны (фосфатидилхолина ифосфатидилинозитола) арахидоновой кислоты [50]. Активированная черезсопряжённые с Gs-белками рецепторы для ФАТ фосфолипаза С катализируетэтот процесс. Арахидоновая кислота способна метаболизировать, вновь включатьсяв фосфолипиды или диффундировать из тромбоцитов. Высвобождение арахидоновойкислоты из фосфолипидов тромбоцитов могут катализировать также фосфолипаза А2и глицеролипаза. Образовавшаяся арахидоновая кислота может окисляться двумяферментами: цитоплазматической циклооксигеназой (ЦОГ) и мембранносвязаннойлипоксигеназой (ЛОГ). При действии ЦОГ образуются нестабильные циклическиеэндопероксиды, которые превращаются в простагландины G2 и Н2, тромбоксан А2,простациклин с дальнейшим образованием из них 6-кето-простагландина Е1,12-гидрокси-5,8,10-гептадекатриеновой кислоты, тромбоксана В2 ималондиальдегида. Конечными продуктами липоксигеназного пути окисленияарахидоновой кислоты являются 12-гидрокси-5,8,10,14-эйкозатетраеновая кислота(12-НЕТЕ) и лейкотриены [36]. Образующиеся из арахидоновой кислотыпростагландины и тромбоксан А2 (ионофор кальция) являютсяагрегантами. Простациклин, синтезируемый клетками эндотелия кровеносныхсосудов, напротив, мощный ингибитор агрегации тромбоцитов.

Связывание АДФ соспецифическими рецепторами плазматической мембраны тромбоцита приводит кувеличению концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток (увеличивается егопоступление из внешней среды и из внутриклеточных запасов) [33]. Кроме того,происходит активация фосфолипазы А2, которая стимулирует высвобождениеарахидоновой кислоты из фосфолипидов мембраны и образование из неё тромбоксанаА2 – активного проагреганта и вазоконстриктора. Форма тромбоцитовизменяется без сопутствующей активации фосфолипазы С, что сопровождаетсяингибированием аденилатциклазы [61, 77]. Реализация метаболических эффектовактивации АДФ-рецепторов тромбоцитов осуществляется через сопряжение смембранным G-белком. Сегодня известно, что при активации на поверхности каждоготромбоцита появляется до 50–100 тысяч гликопротеиновых рецепторов [76].Экспериментальные данные многих клинических исследований свидетельствуют, чтоудаление из среды АДФ или связывание АДФ-рецепторов с конкурентным антагонистомсущественно угнетает агрегацию тромбоцитов [72, 76, 78, 81].

Для серотонина на поверхности тромбоцитов существует два типа рецепторов– ионные каналы и рецепторы, сопряжённые с G-белком [40,45]. Согласно [47], механизм действия серотонина состоит в регуляциицАМФ-зависимых путей,  и поэтому реакция на серотонин способна блокироватьсястимуляторами аденилатциклазы и ингибиторами фосфодиэстеразы. Серотонинстимулирует поступление ионов кальция из плазмы в тромбоциты черезрецепторуправляемые каналы для двухвалентных катионов, запускаяфосфатидилинозитоловый цикл с образованием фосфатидной кислоты, являющейсякальциевым ионофором. Активация G-белков, сопряжённых с другимтипом серотониновых рецепторов приводит к активации фосфолипазы С, котораягидролизует трифосфатидилинозитол (или фосфатидил-4,5-бифосфат) вдифосфатидилинозитол (фосфатидилинозитол-4-фосфат) с образованием1,2-диацилглицерола (ДАГ), который фосфорилируется в фосфатидную кислоту (ФК).Это самые ранние этапы активации тромбоцитов. Диацилглицерол стимулирует Са2+-активируемыефосфолипидзависимые протеинкиназы (в частности, ПК С), которые фосфорилируютбелки. Фосфатидная кислота – кальциевый ионофор, высвобождает кальций извнутриклеточных депо, присоединяя к своим фосфатным группам. Ионы кальциястимулируют работу актина и миозина микрофиламентов, в результате чего гранулытромбоцитов перемещаются к системе открытых каналов, осуществляется реакциявысвобождения собственных агрегантов, что усиливает собственный ответ клетки иактивирует другие тромбоциты.

Таким образом, активация тромбоцитов начинается при взаимодействииагрегантов с рецепторами плазматической мембраны. Важную роль в передачесигнала внутрь тромбоцита играют G-белки плазматической мембраны, атакже изменение проницаемости мембраны для ионов (если рецептор являетсяионофором) [38].

1.2. Роль рецепторов плазматическоймембраны в процессах агрегации тромбоцитов человека

В настоящее время установлено, что важным моментомтрансмембранной передачи сигналов является изменение интенсивности транспорта ивнутриклеточной концентрации различных ионов. Одной из основных систем,приводящих к изменению внутриклеточной концентрации ионов, являются селективныеионные каналы биомембран, представляющие собой интегральные мембранные белки,способные при определённых внешних воздействиях (изменение потенциала намембране, действие медиатора или гормона) избирательно менять проницаемостьмембраны для конкретного вида ионов [26]. Агрегацию тромбоцитови вазоконстрикцию индуцирует 5-гидрокситриптамин (серотонин), который такжесинергически усиливает эффекты тромбоксана А2, ангиотензина II,АДФ и коллагена [55]. Эта активность проявляется через взаимодействие соспецифическими рецепторами на поверхности тромбоцитов – 5-НТ-рецепторами(рецепторы 5-гидрокситриптамина) [46]. Серотонин (5-гидрокситриптамин) являетсяпроизводным триптофана и синтезируется в клетках пищеварительного тракта,нервных (серотонинэргических) и тучных клетках; способен накапливаться вспециальных гранулах тромбоцитов. Физиологическоедействие серотонина в организме человека разнообразно, он является лигандом длярецепторов клеток практически всех внутренних органов и тканей [67, 87].Фармакологические эффекты серотонина коррелируют главным образом с возбуждением5-НТ2 рецепторов [51, 52, 63]. Исследователями [48, 62, 66, 69, 70]синтезировано множество соединений, способных связываться с этими рецепторами имодулировать их функционирование. Установлено, что рецепторы для5-гидрокситриптамина (серотонина) находятся на клетках практически всехвнутренних органов человека, регулируя многие процессы жизнедеятельности.Классификация 5-НТ рецепторов на семь семейств (от 5-НТ1 до 5-НТ7)основана на структурных, функциональных и фармакологических критериях [58].Семейства в свою очередь  делятся на подсемейства [67, 80]. Выяснено, чтонекоторые 5-НТ рецепторы связаны с G-белками[40]. Рецепторы серотонина, расположенные на тромбоцитах и клетках гладкоймускулатуры сосудов относятся к подтипу 5-НТ2А рецепторов, остальныепредставители этого подтипа – 5-НТ2В  и 5-НТ2Слокализованы только на нейронах [71, 80, 84].

Есть данные о примерномрасположении в мембране и структуре активного центра 5-НТ4 рецептора.

Представители некоторых семейств 5-НТ рецепторов синтезируются сиспользованием методов генной инженерии in vitro,выделяются методом микродиализа [82] или экстракцией из клеточных мембран [74].На плазматической мембране тромбоцитов локализованы два типа рецепторов длясеротонина [75].

Исследованиями [11, 55] показана зависимость снижения агрегационнойспособности тромбоцитов от геометрии молекулы изучаемого вещества. Есть данныео том, что сродство к 5-НТ2 рецепторам увеличивается при наличииобъёмного адамантил-заместителя [44]. Так же доказано антагонистическоедействие  SB-699551-A (3-циклопентил-N-[2-(диметиламино)этил]-N-[(4¢-{[(2-фенилэтил)амино]метил}-4-бифенилил)метил]пропанамиддигидрохлорид), имеющего объёмное, сложное молекулярное строение на 5-НТ5Арецепторы мозга свиньи [82].

Ионотропныерецепторы для серотонина являются членами суперсемейства мембранных белков,которое включает также рецепторы для никотина, глицина, γ-аминомаслянойкислоты (ГАМК). Все они обладают одинаковыми свойствами – один и тот же белокявляется и рецептором и ионным каналом, сформированным различными комбинациями2α, β, γ, δ и ε субъединиц. Лиганд рецептора этогосуперсемейства связывается с α-субъединицей и стимулирует открытиенеспецифического ионного канала [17].

Большинстворецепторов относятся к семейству мономерных гликопротеинов, семикратнопересекающих мембрану. Они выполняют разнообразные биологические сигнальныефункции. К таким рецепторам относятся адренорецепторы и рецепторы для АДФтромбоцитов, а так же часть 5-НТ рецепторов тромбоцитов. АДФ активируеттромбоциты через их три аденозинфосфат-зависимых рецептора: Р2Х, П2И и Р2Т[64]. Гликопротеиновые рецепторы имеют очень древнее происхождение. Ихиспользуют, например, клетки дрожжей, которые выделяют необходимые для спариванияполипептидные факторы и распознают их с помощью поверхностных рецепторов,представляющих собой все те же семикратно пересекающие мембрану рецепторы.

Уникальнаяструктура лиганд-связывающих участков семикратно пересекающих мембранурецепторов позволяет связывать лиганды различной природы и молекулярной массы вшироком диапазоне от 32 для Ca2+ до более чем 102 кДа длягликопротеинов.

Большинствообычных низкомолекулярных гормонов (типа адреналина и ацетилхолина) связываетсяс участками внутри гидрофобного ядра (a). Пептидные и белковые лигандыприсоединяются к внешней поверхности рецептора (b, c). Некоторые лигандынизкого молекулярного веса, Ca2+ и аминокислоты (глутамат, ГАМК)связываются с длинными участками на N-конце, индуцируя их переход в новуюконформацию, в которой длинный участок взаимодействует с рецептором (d). Вслучае рецепторов, активируемых отрезающей протеазой (e), новый N-конецдействует как автолиганд. Отрезанный пептид может также взаимодействовать сдругим рецептором.

1.3. Биологическая активность производных адамантана

Производныеадамантана как физиологически активные вещества находят широкое применение с70-х годов XX века [20]. Сам адамантан (трицикло[3.3.1.1.]декан, С10Н16)принадлежит к числу трициклических нафтенов мостикового типа (рис. 6).

/>

Рис. 6. Структура молекулы адамантана.

Молекулаего состоит из трёх конденсированных циклогексановых колец в конформациикресла. Пространственная модель молекулы адамантана – высокосимметричнаяконструкция с малой поверхностью и незначительными силами межмолекулярноговзаимодействия в кристаллической решётке [23]. Из всех трициклическихуглеводородов адамантан наиболее устойчив, что объясняется тетраэдрическойнаправленностью связей всех атомов углерода и их фиксированным положением.

Биологическая активность производныхадамантана обусловлена симметрией и объёмностью пространственного строения,значительной
липофильностью жёсткого углеводородного каркаса адамантана, что позволяет имлегко проникать через биологические мембраны [3]. Поэтому модификацияорганических соединений с помощью адамантильного радикала значительно изменяетих биологическую активность, нередко усиливая её. С помощью метода спиновыхметок было показано, что адамантан, попадая в липидный бислой, способенразрушать гексагональную упаковку метиленовых группировок, характерную длядвойного слоя фосфолипидов, и нарушать осевое расположение алкильных цепейфосфолипидов, модифицируя тем самым функциональные свойства клеточных мембран[18]. Принимая во внимание важность порядка расположения метиленовых групплипидов биологических мембран как фактора функционирования связанных смембранами ферментов, можно отметить косвенное влияние адамантана на ихактивность.

На данный момент синтезировано более 1000 новыхпроизводных адамантана. Фармакологическое изучение показало наличие среди нихвеществ, обладающих выраженной психотропной, иммунотропной, противовирусной,курареподобной, антикаталептической, противоаллергической активностями, а такжесоединений, влияющих на ферментативную систему печени [37]. Амидыадамантанкарбоновых кислот проявляют антибактериальную активность [30].

Есть данные о результатахмодификации молекулы энкефалина аминокислотами ряда адамантана. Введённый вположение 5 молекулы энкефалина (S)-адамантилаланинпридаёт опиоидному пептиду резистентность по отношению к ферментам, легко разрушающимнемодифицированный энкефалин (химотрипсин, проназа, нейтральная протеаза,термолизин) [24].

Показано, чтофизиологической активностью обладают азотсодержащие производные. Первым в медицинскую практику в 1966 г.  вошёлгидрохлорид 1-аминоадамантана, обладающий противовирусной активностью вотношении штаммов вирусов типа А2, его фирменные названия: мидантан,симметрел, амантадин. Эти препараты используются для профилактики респираторныхзаболеваний, т. к. обладают способностью блокировать проникновение вируса вклетку. Предполагают, что данные препараты способны работать на начальныхэтапах репродукции вируса, блокируя синтез вирусоспецифичных РНК [3].Противовирусная активность некоторых аминопроизводных адамантана связана с ихспособностью ингибировать ПК С [39]. Ремантадин (полирем, флумадин), каклипофильное слабое основание способен повышать рН эндосомального содержимого ипрепятствовать депротеинизации вируса [1].

 В клинической практикедля лечения вирусных заболеваний применяются также такие препараты, какацикловир (виролекс, герпесин, зовиракс, лизавир, суправиран), диданозин,фоскарнет (триаптен), ганцикловир (цимевен), ламивудин, рибавирин (виразол,рибамидил), ставудин, трифлуридин, видарабин, зальцитабин (хивид), зидовудин(азидотимидин, ретровир) [9]. Однако, у большинства этих препаратовотносительно узкий спектр противовирусного действия, их недостатком являетсяналичие  разнообразных побочных реакций, появление резистентных штаммов вирусови др. [25, 35].

Противовируснойактивностью в отношении штаммов вирусов типа А2 обладают ипроизводные алкиладамантанов: 1-гидрокси-3,5диметил-7-этиладамантан,1-метокси-3,5диметиладамантан, которые, в отличие от мидантана, показаливысокую противовирусную активность и в отношении штаммов strains of rhino viruses и herpes simplex [3]. Рядгидрокси-, галоген- и меркаптопроизводных амидов адамантана тоже обладаютпротивовирусной активностью [7, 19].

Показано, что амантадинспособен препятствовать развитию очагов саркомы на зародышевой культуре, другиепроизводные адамантана могут служить снотворными средствами, антималярийнымипрепаратами,  инсектицидами [37]. В экспериментах с использованиемВИЧ-инфицированных человеческих лимфобластоидных клеток показано, что некоторыепроизводные адамантана обладают анти-ВИЧ-активностью [21]. Мидантаниспользуется в неврологической клинике для лечения болезни Паркинсона ипаркинсонического синдрома. Подобную активность проявляют хлорангидриды3,5,7-алкилзамещённых 1-аминоадамантанов, некоторые из которых обладают антагонистическимидофамину свойствами. Некоторые четвертичные аммониевые основания с2-адамантильным радикалом способны действовать как миорелаксантыпериферического действия (курареподобная активность). Производные1-аминоадамантана и 3,3-диамино-1,1-диадамантила противокаталептически активны,бактериостатическое влияние оказывают адамантанкарбоновые кислоты и фосфатыадамантантиолов и их производных. Диалкиламиновые эфиры адамантантиокарбоновойкислоты проявляют бактерицидную, фунгицидную, гербицидную активность [12].Натриевая соль β-(1-адамантан)-пропионовой кислоты обладает желчегоннымдействием. 1-адамантиламмоний-β-хлорэтилоксаминоат и некоторые другиепроизводные адамантана типа 1-AdCH2OCH2CH(OH)CH2NRR΄ обладают анестезирующим действием[3].

Антибактериальноедействие, сравнимое с антибактериальным препаратом 5-нитро-8-гидроксихинолином,оказывают N-(нитрофенил)-адамантил-карбоксамидыи адамантилзамещённые N-(1-метилпиридиний)йодиды[13].

Перфторированный адамантан применяется в качествекомпонента искусственной крови [28]. Есть данные об антиагрегационнойспособности производных адамантана по отношению к различным путям агрегациитромбоцитов [55].

1.4. Производные адамантана, влияющие на агрегацию тромбоцитов

 

Ярко выраженная липофильная природа каркасногоуглеродного фрагмента адамантана обуславливает высокую биологическую активностьего производных. Введение в молекулу производного высоколипофильного радикалаусиливает  его взаимодействие с гидрофобными областями рецепторных молекул[27].

Показановлияние модифицированных адамантильных и амидных фрагментов амидов N-[(адамантоил-1)-фенил]-антраниловойкислоты на 5-НТ2 рецепторы тромбоцитов человека: снижение их АДФ- исеротонин-индуцированной агрегации [11]. Кроме того, известно, что сродство кданным рецепторам обусловлено наличием объёмного адамантильного заместителя[55, 56, 60, 83]. Была предположена биологическая активность ряда1-адамантанкарбоксамидов в качестве антагонистов 5-НТ2 рецепторовтромбоцитов. Высокоспецифическое сродство к изучаемым рецепторам и мощныйантиагрегационный эффект был подтверждён и invitro и invivo для(S)-N-{1-[2-(4-флуорофенил)этил]пирролидин-3-ил}-1-адамантанкарбоксамидгидрохлорид гидрата (10-(S), Y-39241) [55].

Рядсинтезированных адамантильных производных гетерофункциональных соединенийпроявил свойства антагонистов и синергистов серотонина при исследовании ихвлияния на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека [13].

Глава 2. Материал и методы исследования

 

Проведено исследование влияния наиндуцированную агрегацию тромбоцитов человека 19-ти производных адамантана сразличающимися по структуре и свойствам заместителями (табл. 1).

Таблица1.

Исследуемые соединения№ Химическая формула вещества Название вещества 1

/>

N-(1-адамантил)-3-аминопиридина гидрохлорид 2

/>

2-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодид 3

/>

4-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодид 4

/>

N-(1-метилпиридиний-3-ил)-адамантил-1-карбоксамид иодид 5

/>

2-[N-(1-адамантоил)амино]-4-бром-1-метилпиридиний иодид 6

/>

3‑(адамантил-1-карбонилокси)-2‑этил‑6-метилпиридин 7

/>

2‑(адамантил‑1‑карбонилокси)-пиридин

Продолжение таблицы 1.

№ Химическая формула вещества Название вещества 8

/>

N-(1-адамантилацетил)-2-аминопиридин 9

/>

N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридин 10

/>

N-(1-адамантилацетил)-3-аминопиридин 11

/>

N-(1-адамантоил)-D,L-триптофан 12

/>

3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индол 13

/>

N-(1-адамантоил)-D,L-гистидин 14

/>

4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоат 15

/>

4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензоат

16

/>

4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензамид

Продолжение таблицы 1.

№ Химическая формула вещества Название вещества 17

/>

4-адамантанкарбоксамидо-5-хлор-N-[2-(диэтиламино)этил]-2-метоксибензамид 18

/>

N-(1-адамантоил)этилендиамина гидрохлорид 19

/>

N,N'-ди-(1-адамантоил)этилендиамин

Эти веществасинтезированы в лаборатории кафедры органической химии СамГУ научнымсотрудником кандидатом химических наук Ермохиным В. А. [13, 14, 15, 16]. Строение вновьсинтезированных соединений доказано данными ЯМР 1Н и ИКспектроскопии (Приложение, табл. 1-4). ИК спектры соединений снимали наспектрофотометре ИКС-29 в таблетках из KBr. Спектры ЯМРполучены на приборе Bruker WP-200 SY (рабочаячастота 200,13 МГц). В качестве растворителя применяли ДМСО-d6, CD3CN, CDCl3. Отсчётхимических сдвигов проводили относительно сигнала ТМС. Для подтвержденияиндивидуальности всех полученных соединений проводили тонкослойнуюхроматографию на пластинках Silufol UV в этилацетате.Соединения № 18 и № 19 были синтезированы ранее [12].

Агрегация тромбоцитов исследована фотометрическим методом Борна [4].Принцип метода основан на регистрации снижения оптической плотности исследуемойплазмы после введения в неё тромбоцитагрегирующего агента. Происходит«склеивание» тромбоцитов, образующиеся агрегаты постепенно оседают и пробаплазмы становится более прозрачной.

Биологический материал предоставлен самарской областной станциейпереливания крови. Кровь, взятую из локтевой вены, стабилизировали 3,8 %раствором цитрата натрия (9:1). Богатую тромбоцитами плазму получалицентрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут. Плазмуразбавляли 0,154 М раствором хлорида натрия, рН 7,2 до достижения оптическойплотности пробы 0,4-0,6 ед. (стандартизация плазмы). Плазму разливали в кюветыпо 2 мл. Изучаемые соединения растворяли в 96 % этиловом спирте. В качествеагрегирующих агентов использовали растворённый в 0,154 М физ. растворе рН 7,2 5-гидрокситриптамин креатин сульфат (серотонин) и АДФ в конечной концентрации1*10-5 М. В эксперименте в качестве агреганта использовался такжеадреналина гидрохлорид в концентрации 0,1 %. Конечные концентрации всехсоединений составляли 0,099 мг/мл. Оптическую плотность измеряли  противконтроля на СФ-46 при длине волны 600 нм, кювета 10 мм (в контрольную пробу добавлялиспирт вместо раствора вещества) в течение 30 минут. Об интенсивности агрегациисудили по изменению оптической плотности относительно контроля, котороевыражали в условных единицах: ∆ А30 (изменение оптическойплотности за 30 минут)´1000=х у. е.

Полученные данные анализировали для установления значений ихдостоверности согласно критерию Стьюдента. Данные считали достоверными приуровне значимости р<0,05 [41].

Глава 3. Результаты и обсуждение

 

Биологическая активностьлюбого химического соединения определяется его структурой, конформацией егомолекулы. В данном эксперименте сначала были выявлены некоторые производныеадамантана, влияющие на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека in vitro. Затем были исследованы механизмы влияния этихсоединений на агрегацию тромбоцитов человека.

3.1.Влияние производных адамантана на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитовчеловека invitro

Адамантилсодержащиепроизводные гидрокси- и аминопиридинов и иодидов N-адамантоил-1-метилпиридиния и О‑адамантоил-N-метилпиридиния. В пробах с добавлением производногоадамантана № 1 агрегация тромбоцитов менее интенсивна по сравнению с агрегациейв контрольных пробах, но это отличие не достоверно (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние N-(1-адамантил)-3-аминопиридинагидрохлорида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=15 Контроль, n=7 1

/>

26,0±3,2 31,0±3,4 Не выявлен

Соединение № 2 отличаетсяот соединения № 1 положением азота аминопиридина и наличием метильной группы уэтого атома азота, заряд азота пиридина в соединении № 2 экранированйодид-ионом, а в соединении № 1 – хлорид-ионом (табл. 1). Несмотря на такиенезначительные структурные различия, соединение № 2 проявило себя как синергистсеротонина в процессе агрегации тромбоцитов (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние 2-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридинийиодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=6 2

/>

57,8±2,0*** 41,2±2,7 Синергист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ٭٭٭- p<0,001 к контролю.

Из полученных данных былсделан вывод о том, что способность изучаемых соединений влиять насеротонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов коррелирует с положением азотапиридина по отношению к кислороду адамантоильной группировки. Вероятно, азотпиридина во втором положении придаёт производному адамантана свойствасинергиста серотонина. Для проверки этого предположения был поставленэксперимент с веществом, азот пиридина которого стоит в четвёртом положении(табл. 4).

Таблица 4.

Влияние 4-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридинийиодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=6 3

/>

30,8±2,6 33,6±2,8 Не выявлен

Предположение подтвердилось: в пробах с 4-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридинийиодидом интенсивность агрегации оказалась почти такой же, как и в контрольныхпробах. Производное № 3 не влияет на серотонин-индуцируемую агрегациютромбоцитов, хотя отличается от производного № 2 только положениемметилированного азота. Чтобы проверить, зависит ли способность соединения № 2влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов от наличия вадамантоильной группировке аминогруппы, поставили эксперимент с веществом скарбоксильной группой (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние N-(1-метилпиридиний-3-ил)-адамантил-1-карбоксамидиодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=6 4

/>

27,6±0,9*** 18,6±1,0 Синергист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ***- p<0,001 к контролю.

Результаты эксперимента с веществом № 4 почти такие же, как и с веществом№ 2, что ещё раз доказывает зависимость биологической активности производныхадамантана именно от положения азота пиридина по отношению к кислородуадамантоильной группировки.

Модификация адамантоильной группировки метилированием и внедрение вмолекулу производного бромид-иона существенно снизило способность полученногосоединения влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека(табл. 6).

Таблица 6.

Влияние 2-[N-(1-адамантоил)амино]-4-бром-1-метилпиридинийиодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=6 5

/>

22,2±1,1 20,6±1,3 Не выявлен

Также “неудачной”оказалась модификация соединения, в результате которой получилось болеегидрофобное производное № 6. 3‑(адамантил-1-карбонилокси)-2‑этил‑6-метилпиридин(соединение № 6), в отличие от предыдущих веществ, не имеет внутримолекулярногозаряда, и почти не проявил биологической активности в отношении агрегациитромбоцитов (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние 3‑(адамантил-1-карбонилокси)-2‑этил‑6-метилпиридинана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=3 6

/>

38,0±3,0 35,0±0,4 Не выявлен

Молекула 2‑(адамантил‑1‑карбонилокси)-пиридинатоже сильно гидрофобна, и тоже почти не повлияла на индуцируемую серотониномагрегацию тромбоцитов (табл. 8).

Таблица 8.

Влияние 2‑(адамантил‑1‑карбонилокси)-пиридинана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=5 7

/>

31,0±1,3 37,0±1,8 Не выявлен

И N-(1-адамантилацетил)-2-аминопиридинпочти не влияет на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, хотя азотпиридина находится во втором положении (табл. 9).

Таблица 9.

Влияние N-(1-адамантилацетил)-2-аминопиридинана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=5 8

/>

48,0±1,6 50,0±2,5 Не выявлен

Значит, если азотпиридина в составе молекулы производного адамантана находится во второмположении, для проявления его биологической активности необходима полярность молекулы,способствующая её гидратации.

Интересно, что N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридиноказался синергистом серотонина (табл. 10).

Таблица 10.

Влияние N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=11 Контроль, n=9 9

/>

44,2±2,1* 36,6±2,9 Синергист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ٭- p<0,05 к контролю.

Подобное аминопиридиновое производноеадамантана с азотом пиридина в третьем положении не влияет на серотониновуюагрегацию тромбоцитов (табл. 11).

Таблица 11.

Влияние N-(1-адамантилацетил)-3-аминопиридинана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=5 10

/>

41,4±0,9 39,0±2,9 Не выявлен

Из всех гидрофобныхадамантил-аминопиридинов синергистическими серотонину свойствами обладаетсоединение, азот пиридина которого находится в четвёртом положении (табл. 10).Из более гидрофильных адамантильных (адамантоильных) пиридиновых производныхсинергистами серотонина оказались аминопиридиновые производные, азот пиридинакоторого находится во втором положении (табл. 3, 5). Заметим, что эти соединения имеютвнутримолекулярный заряд, который облегчает их растворимость в водноймежклеточной среде, сохраняя при этом мембранотропность.

N-адамантоил-α-аминокислоты. Рацемическая смесь триптофановогопроизводного адамантана проявила слабую тенденцию к замедлению серотонин-индуцируемойагрегации тромбоцитов (табл. 12).

Таблица 12.

Влияние N-(1-адамантоил)-D,L-триптофана на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения

Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов,

у. е.

Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=5 11

/>

24,3±1,0 27,8±1,9 Не выявлен

Триптаминовое производноеспособно ускорять серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, а смесь из D- и L-гистидиновых производных напротив, достоверно её замедляет(табл. 13, 14).

Таблица 13.

Влияние3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола насеротонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=11 Контроль, n=6 12

/>

46,0±0,9*** 33,0±3,4 Синергист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ٭٭٭- p<0,001 к контролю.

Таблица 14.

Влияние N-(1-адамантоил)-D,L-гистидина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=5 13

/>

20,8±0,7*** 34,2±3,8 Антагонист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ٭٭٭- p<0,001 к контролю.

Из экспериментальных данных видно, чтосмеси D- и L-аминокислотныхпроизводных адамантана проявляют антагонистические серотонину свойства впроцессе агрегации тромбоцитов, а триптаминовое производное – синергистические.Способность триптаминового производного (3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола) усиливать индуцируемую серотонином агрегациютромбоцитов, скорее всего, связана с его структурным сходством с самимсеротонином (рис.7).

/>

а.                                         б.

Рис. 7. Строение серотонина (а) и3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола (б). Видно сходство структуры серотонина(5-гидрокситриптамина) и биологически активного производного адамантана.

Адамантилсодержащие производные4-аминобензойной кислоты. Первым изпроизводных 4-аминобензойной кислоты был исследован 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоат,который проявил тенденцию к снижению интенсивности серотонин-индуцируемойагрегации тромбоцитов (табл. 15).

Таблица 15.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоата на серотонин-индуцированнуюагрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=6 14

/>

51,3±3,3 58,3±3,8 Не выявлен

Модификация 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоата,в результате которой получился 4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензоат,привела к появлению у нового соединения синергистических серотонину свойств(табл. 16).

Таблица 16.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензоатана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=15 Контроль, n=5 15

/>

48,0±1,2*** 20,0±2,1 Синергист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ٭٭٭- p<0,001 к контролю.

Модификация бензоата до бензамидаприводит к изменению биологической активности производного вплоть до тенденциик замедлению индуцируемой серотонином агрегации тромбоцитов в опытных пробах посравнению с контролем (табл. 17).

Таблица 17.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензамидана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=15 Контроль, n=5 16

/>

24,0±1,1 27,0±1,7 Не выявлен

При хлорировании и оксиметилированиибензамида получается производное адамантана, обладающее свойствами синергистасеротонина (табл. 18).

Таблица 18.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-5-хлор-N-[2-(диэтиламино)этил]-2-метоксибензамидана серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=15 Контроль, n=5 17

/>

50,0±2,5* 39,0±1,1 Синергист

П р и м е ч а н и е: уровеньдостоверности результатов ٭- р<0,05 к контролю.

Адамантилсодержащие производныеэтилендиамина. Ещё два производныхадамантана, которые теоретически должны влиять на серотонин-индуцируемуюагрегацию тромбоцитов, в эксперименте не проявили ожидаемой биологическойактивности. В опытных пробах с добавлением N-(1-адамантоил)этилендиаминагидрохлорида почти такая же интенсивность агрегации тромбоцитов как и вконтрольных пробах (табл. 19).

Таблица 19.

Влияние N-(1-адамантоил)этилендиаминагидрохлорида на серотонин-индуцированнуюагрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=13 Контроль, n=6 18

/>

20,0±0,4 22,0±1,5 Не выявлен

Производное адамантана №19, молекула которого симметрична и включает две адамантоильных группировки,проявило лишь тенденцию к снижению интенсивности индуцируемой серотониномагрегации тромбоцитов (табл. 20).

Таблица 20.

Влияние N,N'-ди-(1-адамантоил)этилендиамина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Структура соединения Интенсивность серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, у. е. Характер действия Опыт, n=10 Контроль, n=5 19

/>

16,0±1,5 20,0±0,9 Не выявлен

Для серотонина намембране тромбоцитов существует два типа рецепторов – ионные каналы ирецепторы, сопряжённые с G-белками[17, 40]. Поэтому серотонин способен индуцировать процессы агрегациитромбоцитов двумя путями, являясь лигандом для двух разных типов рецепторов. Нафункционирование какого типа серотониновых рецепторов влияют добавляемые вопытные пробы соединения, можно проверить аналогичными экспериментами, где агрегантомявляется известный лиганд для рецепторов, сопряжённых с G-белками, например, АДФ и адреналин.Для этих экспериментов было отобрано 5 соединений: соединения № 2, 12, 9,проявившие наиболее выраженное синергистическое серотонину действие (соединения№ 15 и 17 больше не исследовались, так как они оказались неустойчивыми);соединение № 13, проявившее свойство антагониста серотонина и № 14, котороехоть очень слабо, но тоже замедляет серотонин-индуцируемую агрегациютромбоцитов.

Активность вещества № 4почти не отличалось от таковой вещества № 2, их структура тоже мало отличается(табл. 3, 5), поэтому чтоб не усложнять эксперимент, вещество № 4 неисследовалось.

Более чётко влияниеизучаемых соединений на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов видно награфиках зависимости оптической плотности проб от времени.

Снижение оптическойплотности в опытных пробах с добавлением вещества № 2 происходит интенсивнее,чем в контрольных, что говорит о способности этого соединения усиливатьагрегацию тромбоцитов. В опытных пробах с добавлением вещества № 9 оптическаяплотность тоже снижается интенсивнее, чем в контрольных, хотя здесь отличиеопыта от контроля более сглажено. Вещество № 12 тоже усиливаетсеротонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов. Влияние на агрегацию тромбоцитоввещества № 13 замедляет снижение оптической плотности опытных проб. Вещество №14 тоже способно замедлять серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, номенее интенсивно, чем вещество № 13.

 

3.2. Механизмывлияния производных адамантана на индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека invitro

К настоящему моменту в литературе отсутствует информация о возможныхмеханизмах влияния подобных соединений на функционирование тромбоцитарныхрецепторов. Влияние веществ на скорость агрегации тромбоцитов может бытьобусловлено их способностью усиливать сродство серотонина к рецепторам(синергисты) или каким-либо образом блокировать доступ лиганда к своемурецептору. Также возможным является агонистическое влияние на рецептор с малойконстантой ассоциации агониста с рецепторной молекулой. Для проверки данныхпредположений были поставлены эксперименты с веществами без индуцированияагрегации известными агрегантами. Исследования показали, что вещества неспособны самостоятельно индуцировать агрегацию (табл. 21, рис 10).

Таблица 21.

Влияние производных адамантана на не индуцированную агрегацию тромбоцитовчеловека in vitro

№

изучаемого соединения

Интенсивность агрегации тромбоцитов, у. е. Опыт, n=10 Контроль, n=6 2 22,7±1,1 19,8±1,0 9 45,5±3,5 43,3±4,1 12 30,6±4,5 28,7±6,2 13 20,1±1,2 16,2±4,3 14 41,7±3,5 47,8±2,6

а./>

б./>

в./>

г./>

д./>

Рис. 10. Динамика снижения оптическойплотности проб при не индуцируемой агрегации тромбоцитов человека: (а) Вопытные пробы добавляли соединение № 2. (б) В опытные пробы добавлялисоединение № 9. (в) В опытные пробы добавляли соединение № 12. (г)В опытные пробы добавляли соединение № 13. (д) В опытные пробы добавлялисоединение № 14. Интенсивность агрегации в опытных пробах почти не отличаетсяот таковой в контрольных пробах.

Полученные данные свидетельствует о том, чтоисследуемые производные не способны самостоятельно проводить сигнал, а влияютлишь на сродство серотонина к рецептору тромбоцита, модулируя эффективностьпроведения сигнала активации (рис. 8).

Из результатовэкспериментов с добавлением веществ при индукции агрегации тромбоцитов АДФ,представленных в таблице 22,  видно, что 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоат(соединение № 14) способен значительно замедлять АДФ-индуцированную агрегациютромбоцитов. Возможно, эта его способность обусловливает незначительноезамедление и серотонин-индуцированной агрегации.

Таблица 22.

Влияние производныхадамантана на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Интенсивность агрегации тромбоцитов, у. е. Опыт Контроль

2, nоп=11

 nк=8

47,2±0,8* 43,5±1,7

9, nоп=11

 nк=8

62,5±2,9** 47,9±3,2

12, nоп=10

nк=5

62,6±2,8* 45,7±6,3

13, nоп=11 nк=7

43,4±4,1 39,7±3,4

14, nоп=10 nк=8

22,8±1,2** 32,2±3,3

П р и м е ч а н и е: уровнидостоверности результатов ٭- р<0,05; ٭٭- p<0,01 кконтролю.

Очевидно, производное №14 влияет на рецепторы тромбоцитов, сопряжённые с G-белками, блокируя проведение сигнала активации агрегации. А N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридин(производное № 9), напротив, интенсивно ускоряет проведение сигнала и усиливаетАДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. 2-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодид (производное №2) здесь тоже усиливает агрегацию, но не так интенсивно. Вещество № 13 невлияет на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Результат действияиндольного производного (№ 12) несколько размыт высокой ошибкой среднегозначения из-за индивидуальных колебаний показателей плазмы разных людей. Ноускорение агрегации тромбоцитов в пробах с веществом № 12 по сравнению сконтролем достоверно (табл. 22).

Результаты экспериментов с добавлением веществ при индукции агрегациитромбоцитов АДФ показаны на рисунке 11.

а./>

б./>

в./>

г./>

д./>

Рис. 11. Динамикаснижения оптической плотности проб при АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитовчеловека. (а) В опытные пробы добавляли соединение № 2.  (б) Вопытные пробы добавляли соединение № 9.  (в) В опытные пробы добавлялисоединение № 12. (г) В опытные пробы добавляли соединение № 13.  (д)В опытные пробы добавляли соединение № 14.

Заметим, что влияниеисследуемых соединений на АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов наблюдается несразу после их добавления в пробы (как в эксперименте с серотонином), а лишь послеопределённого латентного периода (рис. 11). Это значит, что соединенияначинают влиять на рецепторы для АДФ только после внедрения в плазматическуюмембрану, изменяя их сродство к лиганду.

Снижение оптическойплотности в опытных пробах с соединением № 2 в течение первых 20 минут малоотличается от такового в контрольных, но за последующие 10 минут оно болееинтенсивно и достоверно отличается от контроля. После пяти минут экспозициипадение оптической плотности в пробах с добавлением вещества № 9 интенсивнее.Отличия динамики снижения оптической плотности опытных и контрольных проб вэксперименте с веществом № 12 также начинаются после пяти минут экспозиции.Интенсивность снижения оптической плотности в опытных пробах в эксперименте свеществом № 13 почти не отличается от таковой в контрольных. Соединение № 14способствует замедлению падения оптической плотности опытных проб после 10минут от начала агрегации (рис. 11).

Полученные данные говорято том, что, скорее всего, производне № 2 и 13 изменяют сродство серотонина крецепторам-ионным каналам, а производные № 9, 12 и 14 способны влиять насродство лиганда к своим гликопротеиновым рецепторам (табл. 22).

К гликопротеиновымрецепторам, функционирующим посредством G-белков, относится большинство из множества всех рецепторовклеток (в данном случае тромбоцитов). Возникает вопрос о специфичности влиянияисследуемых производных адамантана. Возможно, среди данных соединенийприсутствуют синергисты других агрегантов, также проводящих сигнал активациипосредством ассоциации с гликопротеиновыми рецепторами. Действительно,предположение подтверждено экспериментом с добавлением веществ при индукцииагрегации тромбоцитов адреналином: вещества № 9 и № 12 ускоряют проведениесигнала и через сопряжённые с G-белкомадренорецепторы, а вещества № 2, 13 и 14  не способны модулироватьфункционирование тромбоцитарных адренорецепторов  (табл. 23, рис. 12).

Таблица 23.

Влияние производныхадамантана на адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№

изучаемого соединения

Интенсивность агрегации тромбоцитов, у. е. Опыт, n=10 Контроль, n=6 2 39,4±1,8 41,5±3,5 9 48,7±5,1* 33,6±4,6 12 46,0±1,2*** 30,3±3,2 13 40,5±3,4 40,2±4,0 14 27,4±1,8 30,2±1,1

П р и м е ч а н и е: уровнидостоверности результатов ٭- р<0,05; ٭٭٭- p<0,001к контролю.

Динамика сниженияоптической плотности в пробах с добавлением соединения № 2 не отличается оттаковой в контрольных (так же и в эксперименте с соединениями № 13 и № 14).Значит, эти соединения не способны влиять на проведение сигнала активации черезадренорецепторы. Добавление в опытные пробы соединения № 9 значительно ускорялопадение их оптической плотности по сравнению с контролем, то же наблюдалось ипри добавлении соединения № 12.

Совершенно очевидно, чтопод влиянием соединений № 9 и 12 увеличивается эффективность того этапа (илинескольких этапов) функционирования гликопротеиновых рецепторов, которыйявляется общим для всех типов этих рецепторов, не зависимо от их специфичности(рис. 12, б, в).

Таким образом, доказаннаяпредыдущими исследованиями [13] биологическая активность аминопиридиновыхпроизводных адамантана подтверждается и в нашем эксперименте: N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридин(№ 9) значительно увеличивает сродство тромбоцитарных рецепторов ко всем используемымв эксперименте агрегантам (табл. 10, 22, 23). Причём это, скорее всего,свидетельствует о его способности к модуляции функционирования гликопротеиновыхрецепторов. Модификация аминопиридинового заместителя в составе производногоадамантана приводит к изменению его активности: 2-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодид (№ 2) усиливает,видимо, сродство серотонина к своим рецепторам со свойствами ионных каналов,почти не влияя на сродство к гликопротеиновым рецепторам (табл. 3, 22, 23).

Исследованиями [55]показана способность объёмных заместителей, вносимых в молекулу адамантана,изменять сродство серотонина к своим рецепторам. Существуют такжеэкспериментально подтверждённые данные о том, что введение в молекулупроизводного высоколипофильного радикала усиливает  его взаимодействие сгидрофобными областями рецепторных молекул [27]. Эти  данные подтверждаются и внашем эксперименте:4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоат (№ 14) действительно имеет подобнуюактивность (табл. 15, 22), способствуя замедлению проведения сигнала активацииАДФ и серотонином. Причём некоторое блокирование проведения сигнала поддействием 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоата наблюдается через 10 минут. Наадреналин-индуцируемую агрегацию он почти не влияет, и причину этого явленияещё предстоит выяснить.

Аминокислотныепроизводные адамантана – 3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индол (№ 12) и N-(1-адамантоил)-D,L-гистидин (табл.1, № 13), – тоже имеют интересную активность. N-(1-адамантоил)-D,L-гистидин, вероятно, антагонистическидействует только на серотониновые ионные каналы тромбоцитов, а3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индол весьма эффективно ускоряет агрегациютромбоцитов, индуцированную и серотонином, и АДФ, и адреналином (табл. 13, 22,23), т. е. его активность направлена на рецепторы гликопротеинового типа.Вещество № 12 интересно ещё и тем, что его структура очень похожа на структурусамого серотонина (рис. 7). Несмотря на то, что вещество № 12, как и серотонин,является производным триптофана, оно не является его агонистом (табл. 21).

Заключение

Влияние производных адамантана на способность тромбоцитов человека кагрегации – одно из многих проявлений их биологической активности. Высокаялипофильность и мембранотропность адамантана, а так же возможность внесения вего структуру разнообразных заместителей, позволяют синтезировать соединения сзаданной биологической активностью. Но, как и все высоко активные вещества,производные адамантана токсичны, так как даже соединения с хорошо изученнымбиохимическим механизмом действия способны вызывать побочные реакции организма.Поскольку в фармакологическую практику всё чаще стали внедряться лекарственныепрепараты на основе производных адамантана, детальное изучение их биохимическихсвойств становится необходимым. Результаты исследований, приведённые в даннойработе, возможно, являются первыми шагами на пути к созданию высокоэффективныхлекарств, позволяющих решить проблемы многих людей, страдающих патологиямисистемы гемостаза.

Скорее всего, биологическая активность производных адамантана поотношению к серотониновым рецепторам – ионным каналам – обусловленаспособностью изменять их конформацию за счёт изменения структуры плазматическоймембраны. Тем более это вероятно, если принять во внимание мембранотропностьадамантанового ядра и канальное строение серотониновых рецепторов. Посколькудругие серотониновые рецепторы как и рецепторы для АДФ и для адреналинаявляются гликопротеинами, и их строение более сложно и менее зависит оториентации фосфолипидных слоёв мембраны, здесь более вероятен механизм модуляции функционирования самого рецептора, в результате чего активация G-белковпроисходит эффективнее.

Проведённые исследования позволили сделать новые выводы относительнозависимости влияния производных адамантана на агрегацию тромбоцитов человека отхимической структуры адамантильных заместителей. Прояснились некоторые вопросы,связанные с механизмами воздействия вновь синтезированных соединений нарецепторы тромбоцитов человека: очевидна их способность изменять сродстволигандов не только к рецепторам – ионным каналам, но и к рецепторам,сопряжённым с G-белком, что определяет направление дальнейшихисследований.

Выводы

 

1.Влияние производных адамантана насеротонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека определяется их структуройи взаимным расположением атомов в молекуле.

2.Производные адамантана оказывают различное действиена индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека, что является следствием ихспособности влиять на функционирование разных тромбоцитарных рецепторов, но ниодно из исследуемых соединений не способно самостоятельно индуцироватьагрегацию тромбоцитов (не имеют свойств агонистов).

3.Усиливающее влияние 2-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридинийиодида наиболее выражено при серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, чтообусловлено его способностью усиливать сродство серотонина к своим рецепторамсо свойствами ионных каналов, почти не влияя на сродство к гликопротеиновымрецепторам (синергист серотонина).

4.N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридини 3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индол усиливают агрегацию тромбоцитов,индуцируемую и серотонином, и адреналином, и АДФ, увеличивая эффективностьодного из этапов функционирования гликопротеиновых рецепторов, общего для всехтипов этих рецепторов.

5.N-(1-адамантоил)-D,L-гистидин, напротив, эффективно замедляетсеротонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, блокируя проведение сигналаактивации серотонином (антагонист серотонина).

6.4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоат способствует замедлениюагрегации тромбоцитов, индуцируемой и АДФ, и серотонином, не влияя при этом наадреналин-индуцируемую агрегацию.

Литература

1.Андронова В. Л. Противовируснаяактивность препаратов ряда адамантана. //Антибиотики и химиотерапия. — 1996. — 41, № 718. — С. 26-30.

2.Антоников И. М. Форма тромбоцитовкрысы на различных этапах процесса их агрегации. // Вестн. Акад. мед. наук. — 1981. — 55, № 6. С. 78-79.

3.Багрий Е. И.  Адамантаны: получение,свойства, применение. — М.: Наука, 1989. — 264 с.

4.Балуда В. П., Баркаган З. С.,Гольдберг Е. Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. — Томск, 1980. — 84 с.

5.Балуда В. П., Лукоянова Т. И.Простациклин-генерирующая система стенки сосудов и тромбогенез. // 1 Всесоюзнаяконференция, Поражение сосудистой стенки и гемостаз. (Полтава, 1981). — С. 20.

6.Белушкина Н. Н., Северина И. С.Торможение АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов гуанидинотиолами – новымклассом активаторов гуанилатциклазы и субстратов NO-синтазы. // Биохимия. — 1996. — 61, № 12. — С. 2140-2146.

7.Вотяков В. И., Бореко Е. И., ВладыкоГ. В., Карако Н. И., Коробченко Л. В. Поиск соединений, активных в отношениивирусов гриппа и возбудителей других ОРВИ. // Химиотерапия и химиопрофилактикагриппа и ОРЗ. (Сб. науч. трудов). — Л., 1990. — С. 150.

8.Воробьёв В. Б. Физиология гемостаза.- Ростов-на-Дону: Изд. дом Профф. Пресс, 2004. — 192 с.

9.Врынчану Н. А. Острая токсичностьновых производных адамантана и норборнана. // Токсикология лекарств. – Киев:Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, 2001. – С. 20-25.

10.  Голубева М. Г.Роль адренорецепторов в регуляции системы свёртывания крови. // Физиологиячеловека. — 1989. — 15, № 6. С. 127-137.

11.  Даниленко Г. И.,Мохорт М. А., Триус Ф. П. Синтез и биологическая активность производных адамантана.N-(адамантоил-1)антраниловые кислоты.// Хим.-фарм. Журн. — 1973. — 17, № 10.С. 15-17.

12.  Даниленко Г. I., Рибалко С. Л., Максимов Ю. М. таінш. Пошук інгібіторів ВІЛ та герпесу серед похідних каркасних сполук тапіридинкарбонових кислот // Биополимеры и клетка. — 1999. — 15, № 3 – С.207-212.

13.  Ермохин В. А. Синтез и биологическая активность адаманитлпроизводныхгетерофункциональных ароматических аминов и азотсодержащих гетероциклов: Автореф. дис.… канд.химич. наук. – Самара, 2007. — 22 с.

14.  Ермохин В. А., Зарубин Ю. П., Пурыгин П. П., Золотарёв П. Н. Синтез иантибактериальная активность N-(нитрофенил)-адамантил-1-карбоксамидови адамантансодержаших иодидов N-метилпиридиния. // Вестник СамГУ.Естественнонаучная серия. – 2007. – 56, № 6. – С. 378-384.

15.  Ермохин В. А., Пурыгин П. П., Зарубин Ю. П. Адамантановые производныеэфиров и амидов 4-аминобензойной кислоты. // Вестник СамГУ. Естественнонаучнаясерия. – 2006. – 49, №  9. – С. 92-96.

16.  Ермохин В. А., Пурыгин П. П., Клёнова Н. А. Синтези гемолитическая активность N-адамантоилзамещённыхгетероциклических аминов и анилинов. // Вестник СамГУ. Естественнонаучнаясерия. – 2004. – 34, №  4. – С. 138-144.

17.  Зинченко В. П.,Долгачева Л. П. Внутриклеточная сигнализация. – Пущино: Электронноеиздательство «Аналитическая микроскопия», 2003. – 84 с.

18.  Индулен М. К.,Колнина В. А., Рязанцева Г. М., Бубович В. И. Механизмы антивирусного действияпроизводных адамантана. Под ред. М. К. Индулен. — Рига: Знание, 1981. – 168 с.

19.  Исаев С. Д.,Новикова М. И., Коробенко Л. В. Синтез и биологическая активностьадамантилсодержащих оксазолов и имидозолов. // Физиологически активныевещества: Республиканский межведомственный сборник. – 1991. – 125, № 23. – С.26-31.

20.  Касьян Л. И., КасьянА. О., Голодаева Е. А. // Журнал органической химии. – 2000. – 36, № 12. — С.1776-1779.

21.  Ковалёв И. Е.,Щипулина Н. В. // Доклады Российской академии наук. — 2001. — 378, № 6. — С.819-822.

22.  Козинец Г. И.,Сарычева Т. Г. и др. Атлас клеток крови и костного мозга. Под ред. Г. И.Козинца. – М.: «Триада-Х», 1998. — 160 с.

23.  Колосова Е. А.,Курбатова С. В., Соловова Н. В., Финкельштейн Е. Е., Яшкин С. Н. Топологияполиэдрических молекул на примере производных адамантана. // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. –2001. – 20, №  2. – С. 178-188.

24.  Красуцкий П. А.,Семёнов И. П., Новикова М. Н., Весёлова Т. В. Аминокислоты ряда адамантана.Синтез и противовирусная активность α-аминокислот ряда адамантана и ихпроизводных. // Хим-фарм. Журнал. — 1985. — 57, № 7. — С. 17-25.

25.  Кубарь О. И.Анализ побочных реакций, вызываемых противовирусными препаратами //Безопасность лекарств. – 1997. – 78, № 1. — С. 5-7.

26.  Кульберг А. Я.Рецепторы клеточных мембран. Биохимия мембран. Под ред. А. А. Болдырева. Кн. 4.– М.: Высш. шк., 1987. – 103 с.

27.  Курбатова С. В.,Шумская Н. Ю. Исследование взаимосвязи между структурой и хроматографическимповедением карбонильных производных адамантана в условиях обращённо-фазовойВЭЖХ. // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. — 2004. –34, № 6. – С.158-168.

28.  Литвинов В. П.Биологическая активность производных адамантана. // Химия гетероциклическихсоединений. — 2002. — 50, № 1. — С. 12-39.

29.  Марри Р.,Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2-х томах. Т. 2. Пер. сангл.: — М.: Мир, 1993. – 415 с.

30.  Морозов И. С.,Петров В. И., Сергеева С. А. Фармакология адамантанов. — Волгоград:Волгоградская мед. академия, 2001. — 320 с.

31.  Ноздрачев А. Д.,Баженов Ю. И., Баранникова И. А., Батуев А. С. и др. Начала физиологии: Учебникдля ВУЗов. Под ред. Акад. А. Д. Ноздрачева. — СПб.: «Лань», 2001. – 1088 с.

32.  Панченко Е. П.,Добровольский А. Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможноститерапии. – М.: Спорт и культура,  1999. – 464 с.

33.  Пархоменко А. Н.Патофизиология острого тромбоза в венечных артериях сердца: представления опатогенезе острого коронарного синдрома. – Киев: Инст. кардиологии им. Н. Д.Стражеско АМН Украины, 2004. – 25 с.

34.  Покровский В.М., Коротько Г. Ф., Наточин Ю. В. и др. Физиология человека. Учебник в 2-хтомах. Под ред. В. М. Покровского, Г. Ф. Коротько. – М.: Медицина, 1997. – 368с.

35.  Русяев В. А.,Вотяков В. И., Федоров А. Н. Сравнительная оценка фармакотерапевтическогоэффекта соединения Д-84 и ремантадина при экспериментальной гриппозной инфекциибелых мышей // Антивирусная активность и механизм действия различных химическихсоединений (под ред. Р. А. Кукайн). — Рига: Зинатне, 1979. — С. 49-53.

36.  Самаль А. Б.,Черенкевич С. И., Хмара Н. Ф. Агрегация тромбоцитов: методы изучения имеханизмы. – М.: Университетское, 1990. — 104 с.

37.  Севастьянова В.В., Краюшкин М. М., Юрченко А. Г. Успехи химии адамантана. // Успехи химии. –1970. – 39, № 10. – С. 1721-1754.

38.  Сергеев П. В.,Сейфулла Р. Д, Майский А. И Физико-химические механизмы и гормональнаярегуляция свёртывания крови. – М: Высш. шк., 1974. — 145 с.

39.  Столяров З. Е.,Лященко К. П. Аминопроизводные адамантана и иммунный ответ // Хим-фарм. журнал.– 1995. – 8, № 3. – С. 9-10.

40.  Трифонов Е. В.Психофизиология человека. – М.: Высш. шк., 2004. – 130 с.

41.  Фролов Ю. П.Математические методы в биологии. ЭВМ и Программирование. — Самара: «Самарскийуниверситет», 1997. — 265 с.

42.  Циммерман М.,Ениг В., Вутке В. и др. Физиология человека. В 3-х томах. Т. 2. Пер. с англ.Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса. – М.: Мир, 1996. – 313 с.

43.  Чирков Ю. Ю.,Белушкина Н. Н., Тыщук И. А., Северина И. С. Изменения в активностигуанилатциклазы тромбоцитов человека при АДФ-индуцируемой агрегации. //Бюллетень экспериментальной биол. и медицины. – 1991. – 52, № 2. – С. 152-154.

44.  Bojarski A. J., Mokrosz M.J. et al. The influence of substitution at aromatic part of1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline on in vitro and in vivo 5-HT1A/5-HT2A receptoractivities of its 1-adamantoyloaminoalkyl derivatives. // J. Bioorganic andMed. Chem. – 2002. – 10, N 5. Р. 87-95.

45.  BonaventureP., Nepomuceno D., Miller K., Chen J., Kuei C., Kamme F., and oth. Molecularand pharmacological characterization of seretonin 5-HT2A and 5- HT2Breceptor subtypes in dog. // Europen Journal of  Pharmacology. — 2005. — 513, N3. Р. 181-192.

46.  CerritoE., Lazzaro M. P., Gaudio E., Arminio P. and Aloisi G. 5HT2-receptorsand serotonin release: Their role in human platelet aggregation. // LifeSciences. — 1993. -53, N 3. Р. 209-215.

47.  ClerckF., Xhonneux B., Wiele r. Biochemical mechanisms in 5-hydroxytriptamine-inducedhuman platelet aggregation // Agents Actions.- 1985. — 17, N 2. Р. 220-228.

48.  CohenM. L., Robertson D. W., Bloomquist W. E.  and Wilson H. C. LY215840, a potent5-hydroxytryptamine (5-HT)2 receptor antagonist, blocks vascular andplatelet 5-HT2 receptors and delays occlusion in a rabbit model ofthrombosis. // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1992.- 261, N 5.  Р. 202-208.

49.  CrawfordN., Castle A. Microtudule and contractile submit proteins of blood platelets.Role in haemostatic activities. // Microtubules and microtubule inhibitors. –1975. – 305, N 6. Р. 229-246.

50.  DahlM., Puusten T., Uotila P. The effect of arachidonic acid on the aggregabilityof human platelet rich plasma. // Prostaglandins leicotriens Med. – 1982. – 8,N 2. Р. 133-139.

51.  F. F.De Clerk and A. G. Herman. 5-hydroxyryptamine and platelet aggregation. // Fed.Proc.– 1983. – 42, N 3. Р. 228-232.

52. FredDe Clerck, Benoit Xhonneux, Josée Leysen and Paul A. J. Janssen. Theinvolvement of 5-HT2-receptor sites in the activation of catplatelets. // Thrombosis Research. – 1984. – 33, N 1. Р. 305-321.

53.  FrojmovicM. M., Milton J. C. Human platelet size, shape and related functions in healthand diasease. //  Physol. Rev. – 1982. – 62, N 2. Р. 185-201.

54.  FrojmovicM. M., Milton J. C. Physical. Chemical and functional changes followingplatelet activation in normal and “giant” platelet. // Blood Cells. — 1983. — 9, N 5. Р. 359-382.

55. FujioM., Kuroita T. et. al. N-[1-(Phenylethyl)pyrrolidin-3-yl]-1-adamantanecarboxamidesas Novel 5-HT2 Receptor Antagonists. // Bioorganic and Med. Chem. Lett. – 2000. – 4, N 10. Р.2457-2461.

56.  FujioM., Togo Y., Tomozane H., Kuroita T., Morio Y., Katayama J. and Matsumoto Y.N-{[1-(2-Phenylethyl)pyrrolidin-2-yl]methyl}cyclohexane-carboxamides asselective 5-HT1A receptor agonists. // Bioorganic and MedicinalChemistry Lett. – 2000. — 10, N 6. Р. 509-512.

57.  GearA., R. L. Preaggregation reactions of platelets. // Blood. – 1981. – 58, N 3.Р. 477-490.

58.  HoyerD., Clarke D.E.  and Fozard J.R. et al.International Union ofPharmacology classification of receptors for 5-hydroxytryptamine (Serotonin).// Pharmacol Rev. – 1994. – 10, N 46.Р. 157.

59.  JacobsK. H. Determination of the turn-off reaction for the epinefrine-ingibited humanplatelet adenylate cyclase. // Eur. J. Biochem. – 1983. – 132, № 1. Р. 125-130.

60. KomiotisD., Pananookooln S. J., Zaw K., Dieter J. P., G. C. Le Breton and D. L. Venton.Synthesis of dl-cis- and (4R,5R)-trans-7-[2,2-dimethyl-4-(phenylsulfonyl)-aminomethyl-1,3-dioxolan-5-yl]-5(Z)-heptenoicacid analogues as platelet thromboxane A2 receptor antagonist. //European Journal of Medicinal Chemistry. – 1995. – 30, N 4. Р. 321-326.

61. KrollM. H., Schafer A. I. Biochemical mechanisms of platelet activation. // Blood. –1989. – 74, N 9. Р.1181-1195.

62. Li HuiYang, Demetra Callas, Jean Marc Herbert and Jawed Fareed. Modulation ofplatelet function and vascular smooth muscle contractile actions by a novel,selective, highly potent 5-HT2 antagonist (SR46349). //
Thrombosis Research. — 81, N 5. P. 555-567.

63. Li N., Wallen N.H., Ladjevardi M. and Hjemdahl P. Effects of serotonin on plateletactivation in whole blood. // Blood Coagul. Fibrinolysis. – 1997. — 8, N 27. Р. 517-523.

64. Mahaut-Smith M. P.;Ennion S. J.; Rolf M. G.; Evans R. J. ADP is not an agonist at P2X(1)receptors: evidence for separate receptors stimulated by ATP and ADP on humanplatelets. // Br. J. Pharmacol. – 2000. – 131, N 1. Р. 10-14.

65. Marlar R. A., Kleiss A.J., Griffin J. H. An alternative extrinsic pathway of human blood coagulation.// Blood. – 1982. – 15, N 60. Р. 13-53.

66. Maurer-SpurejE., Pittendreigh C. and Solomons K. The influence of selective serotoninreuptake inhibitors on human platelet serotonin. // Thromb. Haemost. – 2004. – 12, N 91. Р. 119-128.

67. NagatomoT., Rashid M., Abul Muntasir H. and Komiyama T. Functions of 5-HT2Areceptor and its antagonists in the cardiovascular system. //  Pharmacology andTherapeutics. – 2004. – 104, N 1. Р. 59-81.

68. NiewiarowskiS. Platelet release reaction and secreted platelet proteins. // Haemostasis andtrombosis. – 1981. – 11, N 18. Р. 73-83.

69. Ogawa T., Sugidachi A., Tanaka N., Fujimoto K.  andAsai F. Pharmacological profiles of R-96544, the active form of a novel 5-HT2Areceptor antagonist R-102444. // EuropeanJournal of Pharmacology. – 2002. –457, N 20. P. 107-114.

70. P.Anne McBride, J. John Mann, Margaret J. Polley, Amy J. Wiley and John A.Sweeney. Assessment of binding indices and physiological responsiveness of the5-HT2 receptor on human platelets. //
Life Sciences. — 1987. — 40, N 4. Р. 1799-1809.

71. PauwelsP. J. 5-HT receptors and their ligands. // Tocris. Rev. – 2003. – 27, N 25. Р. 1-7.

72. Perri T., Pasini F. L.,Frigerio C. et al. Pharmacodynamics of ticlopidine in man in relation to plasmaand blood cell concentration. // Europ. J.Clin. Pharmacology. – 1991. – 41, N 20. Р. 429-434.

73.  Rao G. H. R., White J.C. Epinephrine potentiation of arachidonate-induce aggregation ofcyclooxygenase-deficient platelets. // J. Biol. Chem. – 1980. – 255, N 8. Р.355-366.

74. Rivail L. et al.Large-scale molecular dynamics of a G protein-coupled receptor, the human 5-HT4serotonin receptor, in a lipid bilayer. // Journal of Molecular Structure,Theochem.  – 2007. – 31, N 48. P. 1-8.

75. Rudnick G., Fishkes H.,Nelson P. J., Schuldiner S. Evidence for two dittinct serotonin transportsystems in platelets. // J. Biol. Chem. – 1980. –  17, N 2.Р. 3638-3641.

76. RupprechtH.-J. Adenosine diphosphate receptor antagonists: from pharmacology to clinicalpractice. // Europ. HeartJ. – 2000. – 2, N 7. Р.1-5.

77. Savi P., Herbert J.-M.ADP receptors on platelets and ADP-selective antiaggregating agents. // MedicalResearch reviews. – 1996. – 16, N 2. Р.159-179.

78. Savi P., Heilmann E.,Nurden P. et al. Clopidogrel: an antithrombotic drug acting on theADP-dependent activation pathway of human platelets. // Clin. Appl. Thrombosis. Hemostasis. – 1996. – 2, N 3.Р. 35-42.

79.  Smith S. K., LimbirdL. E. Solibilization of human platelet α-adrenogetic receptors: evidencethat agonist occupancy of the receptor stabilizes receptor-effectorinteractions. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. – 78, N 7. Р. 4026-4030.

80.  Stanford S. C.5-Hydroxytryptamine. // Neurotransmitters, Drugs and Brain Function. – 2001. –57, N 45. Р. 187-209.

81. ThebaultJ. J., Kieffer G., Cariou R. Single-dose pharmacodynamics of clopidogrel. //Semin Thromb Hemost. – 1999. – 25, N 2. Р. 3-8.

82.  ThomasD. R. et al. SB-699551-A (3-cyclopentyl-N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-[(40-{[(2-phenylethyl)amino]methyl}-4-biphenylyl)methyl]propanamidedihydrochloride), a novel 5-ht5A receptor-selective antagonist, enhances 5-HTneuronal function: Evidence for an autoreceptor role for the 5-ht5A receptor inguinea pig brain. // Neuropharmacology. – 2006. – 51, N 5. Р. 566-577.

83. VickersS. P., Easton N., Malcolm C. S., Allen N. H., Porter R. H., Bickerdike M. J. and Kennett G. A. Modulation of 5-HT2A receptor-mediated head-twitchbehaviour in the rat by 5-HT2C receptor agonists. // PharmacologyBiochemistry and Behavior. – 2001. – 69, N 8. Р. 643-652.

84. Walcourt-AmbakederemoA. and Winlow W. 5-HT receptors on identified Lymnaea neurones in culture:Pharmacological characterization of 5-HT2 receptors. // GeneralPharmacology: The Vascular System. – 1994. – 25,  N 6. Р. 1079-1092.

85.  WhiteJ. G. The secretory pathway of bovine platelets. // Blood. — 1987. – 69, N 3.Р. 878-885.

86. WhiteJ. G., Clawson C. C., Gerrarg J. M. Platelet ultrastuctura. // Homeostasis andthrombosis. Edinburg e. a. – 1981.– 65, N 28. Р. 22-49.

87. MössnerR.  and Lesch K. P. Role of serotonin in the immune system and in neuroimmuneinteractions. // Brain Behavior Immun. – 1998. – 75, N 12. Р. 249.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1.

Данные ИК и ЯМР 1H спектров для иодидов N-адамантоил-1-метилпиридинияи О‑адамантоил-N-метилпиридиния

№

соединения

ИК спектр, n, см-1

Спектр ЯМР 1Н, d (м.д., от ТМС); J, Гц

CH2

СO–NHR Осталь­ные

HAd, HCH2

HAr(Het), HNH

1 2846, 2912

3448,
1690,

1539

1504, 1439

1223, 1176, 1072

1.66 c (12H, CH2),
1.94 c (3H, CH2),

4.25 c (3H, CH3)

8.06 т (1H5, Het), J = 4

8.49 д (1H6, Het), J =2,7

8.67 д (1H4, Het), J = 2

9.43 с (1H2, Het),

9.75 c  (1H, NH)

2

2915,

2870

3300

1690,

1610

1.70c (6H, CH2)

1.92c (6H, CH2)

2.00c (3H, CH)

8.00к (2H, Het)

8.42с (1H, Het)

9.77c (1H, NH)

3

2890,

2850

3475,

1680,

1580

1530,

1500,

1330,

1320

1.67 c (12H, CH2),
1.95 c (3H, CH2),

2.19 c (2H, CH2),
4.36 c (3H, CH3)

8.04 т (1H5, Het), J =4

8.41 д (1H6, Het), J =2,2

8.67 д (1H4, Het), J =1,4

9.38 с (1H2, Het),

10.89 c (1H, NH)

4

2880,

2835

1740

1620,1590, 1520,1395,

1270, 1220

1.67 с (6H, CH2),
1.78 c (6H, CH2),

1.96 с (3Н, СН),

3.61 с (3Н, СН3)

7.16 т (1H5, Het),
7.30 д (1H6, Het),

8.36 м (2H3,4, Het)

6

2880,

2835

1755

1665, 1530,

1440, 1285,

1230

1.14 м (3H, CH3),

1.24 т (2H, CH2),

1.67 с (3H, CH3),

1.74 м (12H, CH2),

2.02 м (3H, CH),
2.45 с (3Н, СН3)

8.14 д (1H5, Het),

8.34 д (1H4, Het)

нет

Таблица2.

Данные ИК и ЯМР 1Н спектров для адамантилсодержащихпроизводныхгидрокси- и аминопиридинов

№

соединения

ИК спектр, n, см-1

Спектр ЯМР 1Н, d (м.д., от ТМС); J, Гц

CH2

СO-NHR

HAd, HCH2

HAr(Het), HNH

5

2910,

2860

3310 1630

1.70 c (6H, CH2),

1.92 c (6H, CH2),

2.00 c (3H, CH)

7.95 д (1H, Het),

8.05 д (1H, Het),

8.42 с (1H, Het),

9.77 c (1H, NH)

7

2910,

2865

1740 ν(С=О), 1590 ν(C=C) Ar, 1215 ν(C–O–C)

1.67 c (6H, CH2),
1.80 c (6H, CH2),
1.96 c (3H, CH)

6.18 т (1H5, Het),

6.31 д (1H6, Het),

7.36 м (2H3,4, Het)

8 2846, 2900 3255 1685

1.63 c (12H,CH2),
1.92 c (3H, CH2),
2.15 c (2H, CH2)

7.06 т (1H4, Het, J = 3,

7.74 т (1H5, Het), J = 4,

8.09 д (1H6, Het), J = 4,

8.28 д (1H3, Het), J= 4,
10.20 c (1H, NH)

9 2850, 2900

3440,
3230

1676

1.62 c (12H, CH2),
1.92 c (3H, CH2),
2.09 c (2H, CH2)

7.57 с (1H2,6, Het),

8.38 с (1H3,5, Het),

10.09 c (1H, NH)

10

2880,

2820

3370 1650

1.63 c (12H, CH2),
1.94 c (3H, CH2),
2.10 c (2H, CH2)

7.42 д (1H6, Het), J = 1,4,

8.07 т (1H5, Het), J = 4,

8.24 д (1H4, Het), J = 5,

8.78 с (1H2, Het),

10.12 c (1H, NH)

Таблица 3.

ДанныеИК и ЯМР 1Н спектров для N-адамантоил-α-аминокислот

№

соединения

ИК спектр, n, см-1

Спектр ЯМР 1Н, d (м.д., от ТМС); J, Гц

ν(C–H) Ad

n(N–H), n(C=O)

HAd, HCH2

HAr(Het), HNH

11 2908, 2850 3394, 3317, 1720, 1693, 1654

1.65 м (6H, CH2),

1.76 м (6H, CH2),

1.94 c (3H, CH),

2.80 с (1H, СН),

4.15 м (2H, CH2)

6.96 м (1H, Het ),

7.04 м (1H, Het),

7.10 с (1H, Het),

7.27 м (1H, Het),

7.45 м (1H, Het),

7.53 м (1H, NH),

8.40 c (1H, NH, Het)

12 2908, 2850 3413, 3217, 1693, 1640

1.65 м (6H, CH2),

1.76 м (6H, CH2),

1.94 c (3H, CH),

2.79 т (7,78 Гц, 2H, СН2)

3.30 к (14,6 Гц 2H, СН2)

6.96 т (7,0 Гц, 1H, Het),

7.04 т (7,0 Гц, 1H, Het), 7.10 д (4 Гц, 1H, Het), 7.33 д (8 Гц, 1H, Het), 7.41 т (6 Гц, 1H, Het), 7.53 д (8 Гц, 1H, NH), 8.88 c (1H, NH Het)

13 2904, 2847 3413, 1700, 1640

1.64 м (6H, CH2),

1.76 д (6H, CH2),

1.92 c (3H, CH),

2.92 м (2H, CH2),

3.99 к (11,24  8 Гц, 1H, CH)

6.59 с (1H, Неt),

6.96 д (6 Гц, 1H, Het),

7.41 д (4 Гц, 1H, NH),

8.43 c (1H, NH Нet)

Таблица4.

ДанныеИК и ЯМР 1Н спектров для адамантилсодержащих производных 4-аминобензойнойкислоты

№ соединения

ИК спектр, n, см-1

Спектр ЯМР 1Н, d (м.д., от ТМС); J, Гц

n(N-H), n(C=O), прочие ν(C-H)Ad 14 3310, 1740, 1680, 1635, 1550, 1280, 850 2912, 2800

1.70 c (6H, CH2); 1.91 c (6H, CH2);

2.01 c (3H, CH);

1.30 т (3H, CH3), J = 7 Гц;

4.27 д (2H, CH2), J = 8 Гц;

7.84 д (2H, Ar), J = 8 Гц;

7.87 д (2H, Ar), J = 8 Гц;

9.36 c (1H, NH)

15 3410, 3198, 1728, 1670, 1450, 1404, 1272,1126 2904, 2851

1.30 м (6H, CH3),

1.70–2.01 м (15H, Ad),

2.48 c (4H, CH2), 3.27 c (2H, CH2),

7.84 д (2H, Ar) J=8 Гц,

7.87 д (2H, Ar) J = 8 Гц,

9.36 с (1H, NH)

16 339–-3213 уш, 1693, 1605, 1542, 1508, 1450, 1411, 1284 2912, 2851

1.27 м (6H, CH3),

1.76–2.01 м (15H, Ad),

2.47 м (4H, CH2), 3.47 м (2H, CH2),

7.21 м (2H, Ar), 7.65 м (2H, Аr),

7.84 c (1H, NH), 9.4 с (1H, NH)

17 3350–3317 уш, 1693, 1605, 1450, 1411, 1284, 1253 2912, 2854

1.24 c (6H, CH3),

1.70–2.08 м (15H, Ad),

2.50 м (4H, CH2), 3.3 м (2H, CH2),

3.80 c (3H, CH3),

7,16 c (H, Ar), 7.25 c (H, Ar),

7.59 д (1H, NH), J=2 Гц,

9.68 с (1H, NH)