Реферат: Содержание аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах здоровых детей и страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом
МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО
ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Биологический факультет
Кафедра биохимии и физиологии человека и животных
С.А. Костогорова
студентка 4 курса
СОДЕРЖАНИЕ АСКОРБИНОВОЙ, ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ И ДИКЕТОГУЛОНОВОЙ КИСЛОТ ВЭРИТРОЦИТАХ ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ И СТРАДАЮЩИХ ИНСУЛИНЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
(курсовая работа)
Научныйруководитель:
к.б.н.,доц. Титова Н.М.
/>
Красноярск, 1999
оглавление
Введение… 2
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ… 3
1.1.биохимические процессы при созревании и старенииэритроцитов… 3
1.1.1. Характеристика эритроцитов… 3
1.1.2. Энергетический обмен в эритроцитах… 5
1.1.3. Антиоксидантная система эритроцитов… 6
1.2. Аскорбат как компонент АОС эритроцитов… 8
1.2.1. Строение и физико-химические свойства аскорбата… 8
1.3. Сахарный диабет как один из распространёенныхпатологических процессов 9
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ… 11
2.1. Подготовка эритроцитов… 11
2.2. Метод раздельного определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновойи дикетогулоновой кислот в эритроцитах… 11
2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ… 13
Глава 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ… 14
ВЫВОДЫ… 15
литература… 16
SUMMARY… 19
Приложение… 20
/>Введение
Зрелые эритроциты млекопитающих – этовысокоспециализированные безъядерные клетки. Основной функцией эритроцитовявляется транспорт кислорода от клетки к тканям и углекислоты в обратномнаправлении. Высокие концентрации кислорода и процессы оксигенации –деоксигенации гемоглобина обуславливают образование высокореакционныхинтермедиатов кислорода, вызывающих нарушение нормального функционированияклетки. Существует антиоксидантная система защиты клетки отсвободнорадикального окисления. В её состав входит ряд ферментов и небелковыхвеществ. Важную роль в антиоксидантной системе играет вещество небелковой природы– аскорбат. Он обладает широким спектром антиоксидантных свойств, в частности,только аскорбат достаточно реакционноспособен для эффективного ингибированияинициации перекисного окисления липидов. Аскорбат блокирует поглощениекислорода и образование перекиси водорода; присутствие аскорбата в клеткахоказывает защитное действие на гемоглобин, препятствуя его окислению. Аскорбатв ходе выполнения своих биохимических функций обратимо переходит в окисленнуюформу – ДАК и ДКГК. Основную роль в биохимических процессах играет редокс-пара– АК/ДАК. По данным литературы, это соотношение может меняться при различныхпатологических процессах, одним из наиболее распространённых из них являетсяинсулинзависимый сахарный диабет. Исследования, направленные на изучениеизменения содержания АК, ДАК и ДКГК в клетках могут быть одним из критериев,свидетельствующих о наличии в организме вышеуказанных процессов.
Целью данной работы явилосьопределение содержания АК, ДАК, ДКГК в общей эритроцитарной массе у детей,страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом. Данная работа представляет собойчасть исследований, проводимых на кафедре биохимии и физиологии человека иживотных КГУ по изучению метаболизма эритроцитов.
/>/>ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ />/>/>1.1.биохимические процессы при созревании и старенииэритроцитов 1.1.1.Характеристика эритроцитов
Зрелый эритроцит человека являетсяупрощенной клеткой по биохимической и структурной организации. Этовысокоспециализированная безъядерная клетка. Эритроциты человека образуются изядросодержащих клеток преимущественно в костном мозге. В этих предшественникахэритроцитов содержатся субклеточные структуры и ферментные системы, необходимыедля деления, созревания, дифференцировки, процессов биосинтеза ДНК, РНК,белков, в том числе глобина, синтеза гема, липидов, углеводов, другихсоединений. На этой стадии развития эритроцита осуществляются окислительныепроцессы, тканевое дыхание, анаэробное расщепление углеводов (гликолиз), прямоеокисление глюкозы через пентозофосфатный путь (Черняк Н.Б., 1976).
До сих пор нет достаточно чёткихпредставлений о том, как соотносятся отдельные стадии созревания ядерных клетокс изменениями химического состава и обмена веществ. Однако известно, что впроцессе развития клетки на стадии нормобласта уменьшается количество РНК,увеличивается содержание гемоглобина и утрачивается способность к синтезу ДНК,в связи с чем нарушается способность к митотическому делению.
Ретикулоциты – безъядерные клетки,образующиеся на последнем этапе созревания, предшествующем образованиюэритроцитов, характеризуются схожей морфологией, в частности, содержатмитохондрии, рибосомы, ЭПР. В ретикулоцитах осуществляется биосинтез глобина,гема, пуринов, пиридиннуклеотидов, фосфатидов, липидов (Фёдоров Н.А., ЧернякН.Б., 1976). РНК практически не синтезируется. Происходит фосфорилирование,сопряжённое с окислением, и гликолиз (Гинодман Л.М., 1968). В обмене веществретикулоцитов участвуют эндогенные и экзогенные субстраты, в том числеаминокислоты, глюкоза.
Последний этап созревания – превращениеретикулоцита в эритроцит – протекает 1-3 дня. Происходят значительные измененияв обмене веществ и морфологии клеток (Фёдоров Н.А., 1976).
В зрелых безъядерных эритроцитахнарушены биологический аппарат дыхания, системы синтеза белка, пуринов, порфиринов.Сохраняется способность к гликолизу, утилизации небольшого количества глюкозы впентозном цикле и синтезу некоторых соединений, например, глутатиона.
В норме длительность жизниэритроцитов поддерживается в течение 120 дней специализированными ферментнымисистемами. Выведение эритроцитов из циркуляции связано с изменениями(структурных компонентов, химического состава, источников энергии),характеризующими старение клеток. Наиболее характерными изменениями пристарении эритроцитов являются:
1) уменьшениеактивности различных ферментов гликолиза и пентозного цикла, что понижаетинтенсивность данных процессов (Мортенсен, Брайн, 1974);
2) уменьшениесодержания липидов, что приводит к изменению структуры эритроцитов, увеличениючувствительности к осмотическому лизису и механическим воздействиям;
3) измененияв составе катионов в результате изменения проницаемости мембраны;
4) изменениесодержания АТР, что в свою очередь связывается как с одной из причин нарушенияпроницаемости, так и с уменьшением приживаемости эритроцитов в кровяном русле.
Одной изведущих гипотез старения является свободнорадикальная гипотеза, предложенная Д.Хартманом. Она связывает причины возрастных изменений с накоплениеммолекулярных повреждений в мембранах и генетическом аппарате клетки свободнымирадикалами и продуктами перекисного окисления липидов. Нарушение нормальногофункционирования клетки обусловлено высокими скоростями образованиявысокореакционных интермедиатов кислорода (супероксидрадикал, пероксидводорода, гидроксильный радикал), что, в свою очередь, связано с постояннопротекающими процессами оксигенации и деоксигенации гемоглобина и наличиемвысоких концентраций кислорода в ходе выполнения основной функции эритроцитов –транспорта кислорода от клетки к тканям и углекислого газа в обратномнаправлении.
1.1.2.Энергетический обмен в эритроцитахДля поддержания функциональнойактивности клеток организма необходима затрата энергии. Зрелые эритроциты,циркулирующие в кровяном русле, являются метаболически активными клетками, несмотряна отсутствие способности к синтезу белков, аэробному расщеплению глюкозы влимоннокислом цикле Кребса (Владимиров Г.Е. по Рапопорту, 1970). Основнымпроцессом обмена энергии в них является гликолиз. Процесс, протекающий вэритроцитах, близок к процессам в других клетках и тканях, и подробно описан(Фёдоров Н.А. по Райкеру, 1976).
К особенностям гликолиза вэритроцитах можно отнести использование, помимо глюкозы, других моносахаридов:фруктозы, маннозы, галактозы, а также инозина, сорбита при наличии соответствующихферментов (Йошикава, 1968). В процессе гликолиза происходит образование АТР и NADH. Энергия гликолиза используется дляактивного транспорта катионов через клеточную мембрану и поддержаниясоотношения между ионами калия и натрия в эритроцитах и плазме, для сохраненияцелостности мембраны и двояковогнутой формы клетки. Образующийся NADH используется для восстановленияпировиноградной кислоты в молочную и для восстановления метгемоглобина приучастии метгемоглобинредуктазы. В составе метгемоглобина содержитсятрёхвалентное железо, вследствие чего он не способен к транспорту кислорода.Характерной особенностью гликолиза в эритроцитах является превращение 1,3-дифосфоглицерата не только в 3-фосфоглицерат, но и в 2,3-дифосфоглицериновуюкислоту под действием дифосфоглицеромутазы. 2,3-дифосфоглицерат имеет, наряду сАТР, важное значение в регуляции сродства гемоглобина к кислороду. По мере старенияэритроцита происходит уменьшение способности к восстановлению метгемоглобина вгемоглобин, т.е. нарушение функциональной активности эритроцита. Это связанноименно с уменьшением интенсивности гликолиза, в результате которого образуется NADH, необходимый для действияметгемоглобинредуктазы. Уменьшение содержания 2,3-дифосфоглицерата приводит ксдвигу диссоциационной кривой влево, ухудшению отдачи кислорода тканям.
Итогом всех реакций гликолизаявляется превращение 1 молекулы глюкозы в 2 молекулы молочной кислоты содновременным превращением 2 молекул ADP в 2 молекулы АТР.
Наряду с гликолизом – анаэробным расщеплениемглюкозы до молочной кислоты – в эритроцитах существует дополнительный путьутилизации глюкозы – прямое окисление до углекислого газа и воды в ходепентозофосфатного цикла. Этот путь неотличим от подобных процессов, протекающихв других клетках и тканях; суммарным результатом цикла является окисление однойиз 6 молекул глюкозо-6-фосфата до 6 молекул СО2 и восстановление 12молекул NADPH. Роль пентозного цикла в зрелыхэритроцитах заключается, с одной стороны, в образовании пентозофосфатов. В реакциицикла образуется 3-глицероальдегидфосфат, подвергающийся превращениям в цепигликолитических реакций и, таким образом, является дополнительным источникомэнергии. Основное значение пентозофосфатного цикла заключено в образованиимолекул NADPH. Значение NADPH определяется его участием в ряде реакций, необходимыхдля поддержания функциональной активности и целостности эритроцитов. К нимотносятся восстановление метгемоглобина в гемоглобин при участии NADPH и метгемоглобинредуктазы ивосстановление окисленного глутатиона с помощь. NADPH- глутатионредуктазы. Восстановленный глутатион (GSH), форма со свободно реагирующейтиоловой группой составляет в эритроцитах до 96% общего количества. Сохранениеглутатиона в восстановленном состоянии необходимо для предохранения ряда ферментов,содержащих SH- группы, от инактивации, ограждениемембраны клетки от действия перекисей и необратимого окислительногоденатурирования гемоглобина.
1.1.3.Антиоксидантная система эритроцитовОсновная функция эритроцитов –транспорт кислорода от лёгких к тканям и СО2 в обратном направлении.Благодаря высоким концентрациям кислорода и постоянно протекающим процессамоксигенации – деоксигенации гемоглобина, в этих клетках с высокой скоростьюидут процессы образования свободных радикалов: Н2О2, ОН-.Кроме того, в эритроцитах в результате аутокаталитических реакций образуютсяперекиси и гидроперекиси липидов.
Основное количество О2-в эритроцитах образуется при аутоокислении гемоглобина в метгемоглобин. Этопример генерации супероксидного радикала, связанной с неферментативным окислениемсубстрата:
Hb+ O2 Û Hb…O2 Û MetHb + O2-
Большую роль в защите клетки от свободныхрадикалов играют ферментативные антиоксиданты. Эритроциты содержатвысокоактивную супероксиддисмутазу, которая осуществляет дисмутацию двух O2-с образованием перекиси водорода:
O2-+ O2- Û H2O2 + O2
Образовавшаяся перекись водорода,являющаяся сильнейшим окислителем, частично нейтрализуется неферментативнымпутём при непосредственном участии аскорбата или других антиоксидантов (a-токоферол, глутатионвосстановленный). Основное количество Н2О2 расщепляется вреакциях, катализируемых каталазой и глутатионпероксидазой:
Н2О2+ Н2О2 Þ 2Н2О + О2
Н2О2+ RH2 Þ 2Н2О + R
Важную роль в антиоксидантной системеэритроцитов играют легкоокисляющиеся пептиды, содержащие аминокислоты с SH-группой: метионин, цистеин. Особоеместо занимает глутатион – трипептид, образованный цистеином, глутаматом,глицином. В организме он присутствует в окисленной и восстановленной форме (GSH). Основной антиоксидантный эффектглутатион оказывает, участвуя в работе ферментативных антиоксидантов. Глутатионявляется ингибитором активированных кислородных радикалов и стабилизатороммембран. Это связано с тем, что SH-содержащие соединения подвергаются окислению в первую очередь, что предохраняетот окисления другие функциональные группы.
Немаловажный вклад в защиту клетки оторганических радикалов вносят неферментативные антиоксиданты. Эффективнымиперехватчиками органических радикалов являются фенольные антиоксиданты, имеющиев структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильнымигруппами. Имеется несколько тысяч фенольных соединений, обладающих антиоксидантнымэффектом: витамины группы Е и К, триптофан, фенилаланин, убихиноны, большинствоживотных и растительных (каротиноиды, флавоноиды) пигментов. Синтезируетсяароматическое кольцо только у высших растений и микроорганизмов, поэтому многиеиз фенольных антиоксидантов входят в группу облигатных пищевых, которыеэффективно ингибируют О2-, ОН- и индуцируемыеими процессы перекисного окисления (Оксенгендлер, 1985).
Антиоксидантными свойствами обладаютхелатные соединения, связывающие металлы переменной валентности (церулоплазмин,мочевая кислота, трансферрин). Тем самым они препятствуют вовлечению их вреакции разложения перекисей, поскольку в присутствии металлов переменной валентностиобразование высокореакционных радикалов усиливается (Эристер, 1987).
Таким образом, развитие ифункционирование клеток в кислородсодержащей среде не представляется возможнымбез существования защитных систем – специализированных ферментативных инеферментативных антиоксидантов. В живых организмах постоянен процессобразования прооксидантов, уравновешиваемый дезактивацией их антиоксидантнымисистемами. Для поддержания гомеостаза регенерация антиоксидантов должна бытьнепрерывной. Отсутствие или нарушение в её непрерывной работе приводит кразвитию окислительных процессов, к накоплению окислительных повреждений, чтосопровождает ряд патологических физиологических процессов, например, старение(Оксенгендлер, 1985).
1.2. Аскорбат как компонент АОСэритроцитов1.2.1. Строение ифизико-химические свойства аскорбатаВитамин С (L-аскорбиновая кислота) входит в состав алифатического ряда витаминов.По своему строению он может быть отнесен к производным углеводов. Этоγ-лактон 2,3-дегидро-L-гулоновойкислоты, производное ненасыщенных полиокси-γ-лактонов. Структура близкаструктуре a-глюкозы.
Благодаря наличию двух асимметричныхатомов углерода в 4 и 5 положениях, аскорбиновая кислота (АК) образует 4оптических изомера и 2 рацемата. D- и L- аскорбиновые кислоты в природе невстречаются и синтезированы искусственным путём.
Наличие в АК двух сопряжённых двойныхсвязей (углерод-углеродной и углерод-кислородной) обуславливает ее способностьк обратимому окислению, продуктом которого является дегидроаскорбиновая кислота(ДАК). ДАК устойчива, но ее лактонное кольцо, в отличие от стабилизированногодвойной связью лактонного кольца L-АК вводном растворе легко гидролизуется с образованием 2,3-дикетогулоновой кислоты(2,3-ДКГК). Эта реакция необратима, ее скорость возрастает при повышениитемпературы и рН среды. Через ряд дальнейших превращений ДКГК переходит вщавелевую и L-треоновую кислоты. Такое же превраще
/> <td/> />ние имеет место в организме(Халмурадов, Тоцкий, 1993):
Способность к О-В превращениям,связанная с ендольной группировкой, которая стабилизирована находящейся в циклесоседней карбонильной группировкой, сопровождающаяся перенесением атомовводорода к акцепторам, является важнейшей каталитической функцией АК в живоморганизме. L-АК по своей биологической активностивысокоспецифична. Витаминная активность проявляется только при наличиисвободных гидроксильных групп. Различные функциональные производные по нимлишают молекулу витаминной активности почти полностью, как и гидрирование ненасыщеннойсвязи лактонного кольца. Поэтому L-ДАКимеет витаминную активность, равноценную L-АК, тогда как 2,3-ДКГК полностью ее лишена. Вследствиелегкой окисляемости L-АК – донор Н+,она количественно легко восстанавливает многочисленные соединения, как-то: йод,перманганат калия и другие. L-АК –переносчик Н+ в некоторых ферментативных реакциях живой клетки, оналегко окисляется пероксидазой, цитохромоксидазой, каталазой. L-АК восстанавливает окисленные формы ферментов,окисляясь в ДАК, обратимо легко регенерирующуюся в АК под действием глутатионаза счет его сульфгидрильной группы:
/>
/>
/>
/>
Окисление АК катализируется медью, вменьшей степени – катионами серебра и железа. Имеется предположение, чтоспецифическим катализатором окисления АК в животных организмах является белок,синтезирующийся в печени, осуществляющий транспорт меди, обладающий оксигеназнойактивностью, — церулоплазмин. В меньшей степени окисление аскорбатакатализируют другие катионы, в частности, серебра и железа. Комплексоны,флавоноиды тормозят окислительный распад АК. Некоторые белки ингибируютокисление АК, связываясь с ней или путём образования комплекса с медью –сывороточные глобулины (Борец, 1980). Окисление тормозится –SH содержащими соединениями: сернистаякислота блокирует фермент аскорбиназу; С-SH связывает ионы Cu+, удаляя т. с. катализатор окисления АК из реакции (Киверин,1971).
1.2.2. Биосинтез АК в живом организме
/> <td/> />L-АК синтезируется в растениях иорганизме некоторых животных из D-глюкозычерез лактон D-глюкуроновой кислоты и L-гулоно-γ-лактон или их производное.В процессе биосинтеза происходит превращение соединений D-ряда в соединения L-ряда (Березовский, 1993):
Биосинтез АК в организме животныхпроисходит в клетках печени, почек, надпочечников, гипофиза, стенки тонкогокишечника (Киварин, 1973).
1.2.3. Физиологические свойствааскорбата
Витамин С является постояннойсоставной частью тканей и органов человека. Его поступление в организм должнобыть ежедневным, т. к. аскорбат, играя важную роль в обменных процессах организма,все время расходуется. Он восстанавливает окисленные формы ферментов,активирует некоторые протеазы, тормозит действие амилазы и протеазыподжелудочной железы, активирует эстеразу печени. L-АК участвует в обмене некоторых ароматических аминокислот,регулирует уровень холестерина в крови, усиливает антитоксические функции гепатоцитов(вкупе с глюкозой), норамализирует белковообразование. Витамин С необходим длянормального функционирования клеток, продуцирующих коллаген, активирует и регулируетзритропоэз (способствуя усвоению железа), нормализует нарушенноепротромбинообразование, нормализует процессы свертывания (Андреев; 1996).Аскорбат играет положительную роль в развитии иммунных реакций организма,обладает некоторым детоксицирующим свойством, является существенным факторомпрофилактики и лечения инфекционных заболеваний.
Витамин С оказывает положительноевоздействие на углеводный обмен. Волынский З. М. с сотрудниками показали, чтоповышает синтез гликогена в печени, и что нарастание содержания гликогена впечени, как правило, прямо пропорционально повышению в этом органе витамина С.К такому выводу позволяют прийти многочисленные клинические наблюдения последнеговремени, подтверждающие ценное свойство АК обладать нормализующим действием науровень сахара в крови. Подобный эффект связан с синергическим действиемаскорбата и гормонов – инсулина и адреналина. Витамин С может усиливать действиеинсулина или действовать аналогично ему, способствуя образование гликогена впечени. Синергизм возникает косвенным путем через воздействие инсулина ивитамина С на общегормональный фон организма.
Таким образом, АК оказывает разностороннеевлияние на процессы обмена веществ у здоровых людей, а при различныхпатологических состояниях благоприятствует нормальному течению обмена веществ ифункционированию различных органов и систем организма (Бременер; 1997).
1.3. Сахарный диабет как один из распространенных патологических процессовДиабет сахарный (diabetes mellitus; сахарная болезнь, сахарноемочеизнурение) – эндокринное заболевание, обусловленное дефицитом гормонаинсулина в организме или его низкой биологической активностью; характеризуетсяхроническим течением, нарушением всех видов обмена веществ, ангиопатией.
Сахарный диабет представляет собойсамую распространённую эндокринную патологию. В его развитии существенную рольиграют наследственная предрасположенность и неблагоприятное воздействиеокружающей среды, однако, характер наследственной предрасположенности и такназываемых факторов риска различны при разных типах сахарного диабета.Факторами риска развития сахарного диабета являются появление антител к b-клеткам островков поджелудочнойжелезы, частые вирусные инфекции, гиподинамия, ожирение, нерациональное илинедостаточное питание, стрессы, генетически отягощенный по сахарному диабетуанамнез и другие.
Согласно классификации ВОЗ, различаютдва основных типа сахарного диабета. Это инсулинзависимый (I тип) иинсулиннезависимый (II тип) сахарныйдиабет. Инсулинзависимый сахарный диабет, как правило, развивается у лицмолодого возраста и детей, имеющих генетическую предрасположенность к сахарномудиабету именно данного типа. Инсулиннезависимым сахарным диабетом чаще болеютлица, старше 50 лет (особенно женщины). Наследственная предрасположенностьиграет большую роль, чем при сахарном диабете I – типа.
Механизм развития сахарного диабета сложен и многогранен. Он зависит как от функции самой поджелудочной железы, таки от внепанкреатических факторов. Прежде всего, нарушен обмен углеводов. Из-занедостатка инсулина или других причин затрудняется переход глюкозы в мышечную ижировую ткань, снижается синтез гликогена в печени, усиливается образованиеглюкозы из белков и жиров (глюконеогенез). В развитии этих процессовувеличивается содержание глюкозы в крови. Если в норме оно довольно устойчиво инатощак у здоровых людей колеблется в пределах 3,33 – 35,55 ммоль/л (70 – 100мг%), то при сахарном диабете в зависимости от формы и тяжести течения обычнопревышает 6,00 ммоль/л, достигая 20 –30 ммоль/л и больше.
Диабет у детей и подростковхарактеризуется тяжелым течением и, как правило, острым началом заболевания. Отвремени появления первых признаков заболевания (жажда, похудание, выделениебольшого количества мочи, общая слабость, сухость кожи) до развития тяжёлогосостояния и значительных нарушений обмена веществ, проходит обычно 2 недели.Дети, больные сахарным диабетом, требуют обязательного лечения и постоянноголечебного контроля.
/>/>ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами обследован 41 ребёнок,страдающий инсулинзависимым сахарным диабетом, и 10 человек контрольной группы.Объектом исследования служили эритроциты больных и здоровых детей. Дляполучения эритроцитов кровь брали из локтевой вены капельным способом, вкачестве антикоагулянта использовали гепарин.
Исследования проводили в общейэритроцитарной массе детей, страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом, идетей контрольной группы.
2.1. ПодготовкаэритроцитовСвежую гепаринизированную кровьразливали в центрифужные пробирки по 5 мл. После пятнадцатиминутногоцентрифугирования при 3000 об/мин при 40С отбирались иотбрасывались лейкоцитарный слой и плазма. Эритроциты суспендировали в десятикратном объёме 0.9% раствора NaCl и центрифугировали в течение пятнадцати минут при 3000 об/мин.Супернатант отсасывали, процедуру повторяли 3 раза. Это делалось для болееплотной упаковки эритроцитов.
2.2. Методраздельного определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновойкислот в эритроцитахДля количественных определений АК,ДАК и ДКГК использовали метод J.H. Roe, C.A. Kuether (1943) в модификации В.В. Соколовского, Л.В. Лебедевой, Т.Б.Лиэлуп (1967). Метод основан на взаимодействии 2,4- динитрофенилгидразина с ДАКс образованием в серной кислоте соответствующего озазона. ДАК и ДКГК даюткрасное окрашивание, используемое для фотометрического определения. Длявычисления суммы всех кислот их окисляют 2,6- дихлорфенолиндофенолятом натрия.Содержание АК определяют по разности. Для дифференцированного определения ДАК и ДКГК смесь подвергаютдействию восстановителей, при этом в АК восстанавливается только ДАК. Вкачестве восстановителя использовали димеркаптопропансульфонат натрия (унитиол)
Реактивы:
1. 2.10 М унитиол (0.84 мл 5%раствора ампулированного препарат в 100 мл 0.2 М фосфатного буфера рН 7.0.хранить не более суток).
2. 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ).Хранить в холодильнике не более двух недель.
3. 85% раствор серной кислоты (100 млводы + 900 мл концентрированной серной кислоты).
4. 2% раствор 2,4-динитрофенилгидразинав 9Н серной кислоте, содержащей 0.25% тиомочевины (хранить в холодильнике неболее 1 месяца).
5. 0.001 Н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (краска Тильманса).Хранить в темноте не более 1 недели.
6. 0.9% раствор хлорида натрия(физиологический раствор).
Ход определения.
В три пробирки помещали по 0.5 млупакованных и отмытых от плазмы эритроцитов с известным гематокритом. В первуюприбавляли 0.25 мл физиологического раствора и 0.25 мл унитиола. Послепятнадцатиминутной инкубации при периодическом помешивании суспензии отбирали0.5 мл экстракта, к которому прибавляли 1.5 мл ТХУ.
В две другие пробирки такжеприбавляли по 1.5 мл ТХУ.
В две пробирки вносили по 0.75 млсупернатанта, полученного при центрифугировании смеси упакованных эритроцитов сТХУ. В одну из пробирок добавляли по каплям 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолятанатрия до появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд.В третью пробирку помещали 0.75 мл супернатанта, полученного после центрифугированиясмеси упакованных эритроцитов с физиологическим раствором, унитиолом и ТХУ. Вовсе пробирки добавляли по 0.25 мл 2,4- динитрофенилгидразина и доводили объёмдо 1.25 мл дистиллированной водой, инкубировали при 100 0С втечение 10 минут и охлаждали в ледяной бане. В каждую пробирку добавлялинебольшими порциями 1.25 мл 85% раствора серной кислоты, охлаждая в ледянойбане после каждой порции. Окрашенные растворы фотометрировали через час придлине волны 540 нм.
Концентрацию кислот определяли поформуле:
С =(3*А)/0.085; где
С – концентрация кислот, мг%
3 – концентрация стандартногораствора, мг%
А – оптическая плотность пробы
0.085 – оптическая плотностьстандартного раствора
/>2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВРезультаты исследованийобрабатывались статистически (Лакин И.А., 1976).
/>/>Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ/> <td/> />Целью исследования являлосьопределение содержания аскорбата и его окисленных форм – ДАК и ДКГК в общейэритроцитарной массе взрослых, страдающих ИЗСД, со стажем болезни более 10 лет;сравнение и сопоставление полученных результатов с данными, полученными ранее,в ходе работы со здоровыми детьми и страдающими ИЗСД. В эксперименте участвовал21 взрослый в возрасте от 25 до 40 лет, 37 больных детей и группа контроля,включающая 10 здоровых детей. Результаты исследований отображены на диаграммах./> <td/> />
Рис.1. Содержание общей АК, АК,ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и детей, страдающих ИЗСД (мг%)
Рис. 2. Содержание общей АК, АК, ДАКи ДКГК в эритроцитах взрослых, страдающих ИЗСД (мг%)
Как следует из полученных результатов,в эритроцитах детей и взрослых, страдающих ИЗСД, наблюдается увеличениесодержания окисленной форма АК-ДАК, что может свидетельствовать о нарушениипроцесса восстановления АК в ДАК, большем участии АК в метаболическихпроцессах, нарушении транспорта АК в клетке.
Процентное содержание общей АК, АК,ДАК и ДКГК также демонстрирует превалирование окисленных форм АК надвосстановленной.
/> <td/> />Рис. 3. Содержание общей АК, АК,ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и страдающих ИЗСД (%)./> <td/> />
Рис. 4. Содержание общей АК, АК,ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых, страдающих ИЗСД (%).
Все полученные данные согласуются сданными литературы об изменении общего количества АК в организме при патологии(нормальное содержание составляет 5 – 15 мг%) и соотношения «окисленная формаАК/восстановленная форма АК» в сторонуувеличения первой.
/>/>ВЫВОДЫ1. Содержание общей АК в эритроцитахдетей и взрослых, страдающих ИЗСД, составляет 19.52 мг% и 6,47 мг%, вэритроцитах здоровых детей – 12.48 мг%.
2. Содержание восстановленной АК вэритроцитах больных детей и взрослых составляет 4.1 и 2,01 мг% (20.5 и 31% отобщей АК), в эритроцитах здоровых детей – 4.28 мг% (33%).
3. Содержание окисленных форм АК – ДАК иДКГК в эритроцитах больных детей и взрослых составляет 15.5 и 4.46 мг% (79.5 и69% от общей АК), в эритроцитах здоровых детей – 8.36 мг% (67%).
4. В общей эритроцитарной массе больныхдетей соотношение окисленная форма АК/ восстановленная форма АК составляет 4/1,что свидетельствует о превалировании окисленной формы АК над восстановленной.
5. В общей эритроцитарной массе здоровыхдетей это соотношение равно 2/1, т.е., налицо тенденция к росту содержаниявосстановленной АК.
Заключение
Уже давно доказали тот факт, чтоаскорбиновая кислота является постоянной составной частью тканей и органовчеловека. Важность выполняемых ею физиологических функций не подлежит сомнению.Некоторые из них давно известны и хорошо изучены. Например, то, что витамин Соказывает благоприятное воздействие на работу иммунной системы, нормализуетэритропоэз и продукцию коллагена, является компонентом антиоксидантной системыклетки. Однако многочисленные исследования недавнего времени показали, чтовозможности этого вещества гораздо шире, чем представлялось до сих пор. Кпримеру, было обнаружено ценное свойство аскорбата нормализовать уровень сахарав крови, оказывая положительное воздействие на углеводный обмен. При выполненииэтой и других биохимических функций аскорбиновая кислота обратимо окисляется вДАК, при последующем воздействии окислителя необратимо переходит в ДКГК. Поданным литературы, соотношение «окисленная форма АК/восстановленная форма АК» может изменяться при различныхпатологиях, как и ее общее содержание в организме. Одной из распространенныхпатологий является инсулинзависимый сахарный диабет. Поскольку ИЗСД являетсяэндокринной патологией, протекающей с нарушением углеводного обмена, врегуляции которого аскорбат играет немаловажную роль, было бы логичнымпредположить, что его содержание в организме больного окажется иным, чем уздорового человека. Экспериментальные данные подтвердили это предположение. Ворганизме больного ребенка содержание общей АК повышено на 37 % по сравнению собщей АК и составляет 19,52 мг%, тогда как нормальным считается наличие от 5 до15 мг% аскорбата. Среднее значение АК у здорового ребенка – 12,48 мг%. В товремя как содержание ДКГК в процентном соотношении практически не изменено и составляету больных и здоровых детей 46 и 49,4 % соответственно (6,16 мг% и 8,96 мг%), концентрацияДАК у больных детей повышена против здоровых почти вдвое и составляет 33,5 % вместо17,6 % (6,54 мг% и 2,2 мг%). Основные различия выявляются в процентномсодержании восстановленной формы АК. Ее содержание у здоровых детей составляет33 % общей АК (4,28 мг%), тогда как у больных детей оно ниже на 13 % исоставляет 4,1 мг%. Таким образом, соотношение «окисленная форма АК/восстановленная форма АК» у больных детейсоставляет 4:1, в отличие от здоровых детей, у которых оно равняется 2:1.
На основании этих данных можнопредположить следующие причины подобных изменений содержания общей АК и ееметаболических форм в организме больных ИЗСД детей:
1) При ИЗСД нарушены все виды обменавеществ в организме – углеводный, белковый и жировой. В последнем случае возрастаетколичество свободных радикалов, вследствие чего АОС испытывает большуюнагрузку. Возрастает содержание одного из ее компонентов – аскорбата, он болееактивно включается в метаболические процессы, возможно, тем самым в какой-томере компенсируется снижение концентрации другого ее компонента – С-SH;
2) Почти двукратное возрастание уровняДАК в организме больного ребенка при практически неизменном количестве ДКГКможет свидетельствовать о нарушении процесса восстановления ДАК в АК; возможноснижена активность фермента ДАК – редуктазы. При ИЗСД ее активность снижена на50 %, что приводит к сокращению содержанияС-SH, необходимого для процесса восстановления ДАК в АК.Одновременно снижается активность ГБФДГ, в реакции которой образуетсянеобходимый для работы С-R NADPH;
3) Нарушение транспорта АК в клетке.
Несколько иная картина наблюдается вотношении взрослых, страдающих ИЗСД. Здесь общее содержание АК находится близкок нижнему пределу нормы и составляет 6,47 мг%. Содержание ДКГК составляет 11,4% (0,73 мг%), ДАК – 57,6 % (3,73 мг%), АК – 31 % (2,01 мг%). Сопоставляяэти показатели с таковыми у детей, можно заключить, что активное участие АК вработе АОС решено не количественным, а качественным путем. Так, доля неактивнойДКГК составляет 11 %, тогда как на долю метаболически активных АК и ДАКприходится 89 % от общего количества АК. Такое превалирование активных форм АКособенно в сочетании с повышенным содержанием АК может указывать на своеобразную«адаптацию» фермента ДАК-редуктазы в ходе многолетнего лечения болезни (свыше10 лет). Для подтверждения данных предположений и выяснения механизма приспосабливаемости(если таковая имеется) необходимы дальнейшие исследования.
В настоящее время определенно сказатьможно следующее: страдающие ИЗСД, особенно дети, в процессе лечения нуждаются впроведении антиоксидантной терапии.
/>литература1. Абрамова Ж.И.,Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. –Л.: Наука, 1985.–230 С.
2. Авраамова Т.В., Титова Н.М.Руководство по большому биохимческому практикуму. –Красноярск: Изд-во КГУ,1978, ч.1. –С.80-82.
3. Асатиани В.С. Ферментные методыанализа. –М.: Наука, 1969. –С.26-40.
4. Ахромеева Г.И. Определениедегидроаскорбиновой кислоты в пищевых продуктах //Вопросы питания. –1988. -№3. –С.66-88.
5. Ашкинази И.Я. Разрушение эритроцитов// Физиология системы крови. Физиология эритропоэза. –Л.: Наука, 1979.–С.274-334.
6. Березовский В.М. Химия витаминов.–М.: Пищевая промышленность, 1973. –С.230-300.
7. Борец В.М. Витамины. –М.: Наука, 1980.–29 С.
8. Бохински Р. Современные воззрения вбиохимии. –М.: Мир, 1987. –С.120-154.
9. Браунштейн А.Е. Процессы и ферментыклеточного метаболизма. –М.: Наука, 1987. –44С.
10. Бременер С.М. Витамины. –М.: Медицина, 1974. –194С.
11. Бреслер В.М., Никифоров А.А. Транспорт органическихкислот через плазматические мембраны дифференцированных эпителиальных слоёв упозвоночных. –Л.: Наука, 1981. –С.52-111.
12. Букин В.Н. Биохимия витаминов. –М.: Наука, 1982.–С.17-19.
13. Владимиров Г.Е. Об энергетической функции АТФ вклетке. –Л.: Наука, 1980. –44С.
14. Гаврилов О.К., Козинец Т.И., Черняк Н.В. Клеткикостного мозга и периферической крови. –М.: Медицина, 1985. –288С.
15. Галактионов С.Г. Биологически активные. –М.: Молодаягвардия, 1988. –С.4-84.
16. Григорьев Г.П. Цитохром Р-450 и витамин С //Вопросыпитания. –1983. -№4. –С.5-10.
17. Дегли С., Никольсон Д. Метаболические пути. –М.: Мир,1973. –С.189-196.
18. Домбровская Ю.В. Витаминная недостаточность у детей.–М.: Медицина, 1983. –63С.
19. Ефимов А.С., Бездробный Ю.В. Структура и функцииинсулиновых рецепторов. –Киев.: Наукова думка, 1987. –С.4-104.
20. Канунго М. Биохимия старения. –М.: Медицина, 1982.–194С.
21. Киверин М.Д. Витамин С и профилактика С-витаминозныхсостояний на Севере. –Сев.-Зап. книжное изд., 1971. –С.5-7.
22. Кон Р.М. Ранняя диагностика болезней обмена веществ.–М.: Медицина, 1986. –С.17-42.
23. Косяков К.С. Клиническая биохимия. –Л.: Медицина, 1997.–С.113-118.
24. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты иингибиторы радикальных окислительных процессов // Усп. совр. биол. –1993. –№4.–С.442-455.
25. Мережинский М.Ф. Нарушения углеводного обмена призаболеваниях человека. –Минск.: Медицина, 1987. –С.22-28.
26. Моисеева О.И. Физиологические механизмы регуляцииэритропоэза. –Л.: Наука, 1985. –185С.
27. Мосягина Е.Н., Владимирская Е.Б. Кинетика эритрона//Кинетика ферментативных элементов крови. –М.: Медицина, 1976. –С.101-122.
28. Мосягина Е.Н., Фёдоров Н.А., Гудим В.И. Эритропоэз //Нормальное кроветворение и его регуляция /Под ред. Н.А.Фёдорова. –М.: Медицина,1976. –С.341-457.
29. Новое в гематологии /Под ред.А.И. Воробьёва,Ю.И.Лория. –М.: Медицина, 1974. –С.18-22.
30. Новикова С.Г. На приёме больной сахарным диабетом//Здоровье. –1997. -№3.-С.14-19.
31. Спиричев В.Б. Врождённые нарушения обмена витаминов.–М.: Медицина, 1995. –С.12-19.
32. Патологическая биохимия /Под ред. А.Ф. Симёнова.–М.: Медицина, 1994. –С.130-147.
33. Рубина Х.М. Биохимия эритроцитов //Физиология системыкрови. Физиология эритопоэза. –Л.: Наука, 1978. –С.211-232.
34. Рубина Х.М. Некоторые данные о связи метаболизмаэритроцитов с их кислородно-транспортной функцией //Проблемы гематологии ипереливания крови. –1973. -№8. –35С.
35. Рысс М.Н Витамины. –Л.: Наука, 1963. –С.3-9.
36. Свободные радикалы в биологии /Под ред. У.Прайор.–М.: Мир, 1979. –С.272-308.
37. Смирнов Н.И. Витамины. –М.: Медицина, 1974. –С.34-40.
38. Соколовский В.В., Лебедева Л.В., Лиэлуп Т.Б.Определение аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот вбиологических тканях // Лаб.дело. –1967. -№12. –С.160-162.
39. Суровова А.П. Витамины в нашем рационе // Здоровье.–1997. -№2. –С.17-20.
40. Схимниковский Б.Г. Авитаминозы у детей //Здоровье.–1998. -№6. –С.11-13.
41. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функцииэритроцитарных мембран. –Минск: Наука и техника, 1981. – С.23-56.
42. Черняк Н.Б. Биохимические процессы при созревании истарении эритроцитов //Нормальное кроветворение и его регуляция.–М.: Медицина,1976. –С.159-186.
43. Baker W.I. Urate and ascorbate: theirpossible roles as antioxidants indetermining longevity of mammalian species //Arch. Biochem. and Biophis. –1987.-№2. –Р.451-457.
44. Basu S., Som S., Ded S.Dehydroascorbic acid reduction in human erythrocytes //J. Chromatogr. Biomed.Appl. –1991. -№1-2.–Р.529-542.
45. Burns J., Evans C. Ascorbic acid inhuman erythrocytes // J. Biol. Chem. – 1996. — №4. – P. 223-241.
46. Penney J., Zilua S. Role of ascorbatein our organism // J. Biochem. – 1994. — №2. – P. 37-49.
47. Pradhu H.R., Krishnamurthy S.Inhibition of ascorbate autooxidation by human blood //Curr. Sci. (India).–1986. -№8. –Р.403-405.
48. Sahashi Y., Mioki T., Hasegama T.Reduction of ascorbate in erythrocytes // J. Vitaminol. – 1996. — №12. – P.6 – 14.
49. Thompson R.Q. Ascorbic acid contentof plasma and cellular components of blood //Anal.Chem. –1987. -№8. –Р.1119-1121.
50. Yamazaki M., Mioki T. Ascorbic acidis cellular components // J. Ferment. Technolog. – 1995. — №7. – P. 422-513.
SUMMARY
The main aim of this workis the study of concentration ascorbic acid, dehydroascorbic acid and DCGA inthe human’s erythrocytes. The concentrations of the AA, DAA & DCGA werelearned in the common erythrocytes mass.
Our results showed thatconcentration of AA is lower that concentration of DAA, DCGA.
Приложение 1
СодержаниеАК, ДАК и ДКГК в эритроцитах детей, страдающих инсулинзависимым сахарнымдиабетом (мг%)
№ S АК ДКГК ДАК АК 1 27,32 13,06 7,9 6,36 2 27,68 16,66 8,9 2,12 3 12,56 5,3 3,52 3,74 4 17,86 10,02 4,16 3,68 5 19,78 11 6,36 2,42 6 17,84 10,66 6,70 0,84 7 26,64 12,14 7,8 6,7 8 13,18 4,14 3,88 5,16 9 18,04 10,26 4,40 3,38 10 19,74 11,12 6,22 2,4 11 27 16,94 8,06 2 12 18,14 10,8 6,82 0,52 13 19,76 8,48 4,24 7,04 14 14,82 8,32 5,30 1,2 15 27,52 8,48 9,32 9,68 16 17,01 8,15 6,8 2,06 17 19,5 7,01 9,1 3,39 18 16,4 6,4 5,43 4,57 19 17,7 5,22 7,92 4,56 20 12,4 4,81 6,1 1,49 21 16,33 7,49 6,4 2,44 22 17,77 6,29 9,2 2,21 23 23,27 10,01 7,6 5,66 24 18,8 7,26 8,13 3,41 25 20,5 8,16 7,3 5,04 26 22,55 9,25 6,24 7,06 27 17,74 9,14 6 2,6 28 19,22 7,17 7,3 4,75 29 16,38 6,19 6,29 3,9 30 24,14 10,21 7,24 6,69 31 16,88 8,19 5,3 3,39 32 19,02 9,14 4,9 4,98 33 19,74 6,7 7,16 5,88 34 22,16 10,2 8,12 3,84 35 16,01 6,9 5,49 3,62 36 13,3 7,1 4,2 2,08 37 19,2 9,03 6,59 3,58 S 19,52 8,96 6,54 4,1 % 100 46 33,5 20,5Приложение 2
СодержаниеАК, ДАК и ДКГК в эритроцитах детей, страдающих инсулинзависимым сахарнымдиабетом и здоровых детей
/>
/>/>/>/>/>/>/> форма SАК ДКГК ДАК АК S АК ДКГК ДАК АК
АК М± m М± m М± m М± m М± m М± m М± m М± m
/>
С 19.52 8.96± 0.9 6.54± 0.49 4.1± 0.04 12.48±0.5 6.16±1.01 2.2 ± 0.56 4.28 ± 0.82
±0.89
/>
% 100 46 33.5 20.5 100 49.4 17.6 33
/>
Р <0.01 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 <0.05 <0.01 <0.01