Реферат: Получение моноклональных антител

Министерствообразования Российской Федерации

Самарский Государственный Университет

Реферат натему:

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Выполнила студентка 542 Б группы

биологического факультета СамГУ

Миронова Ирина

Самара

2001

Введение

Для многих исследований, связанных с изучениембиологических структур большую ценность представляют реагенты, способныхспецифически взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом,обладающим указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря нато, что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только сантигеном, то есть с молекулой способной вызвать иммунный ответ, длябольшинства структур удается подобрать условия, при которых они становятсяантигенами и индуцируют выработку комплиментарных антител (например, приконъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большоераспространение иммунологических методов, связанных с использованием антител, вразличных областях биологии и медицины.

Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификации иколичественного определения антигенов в различных областях исследованийпредставляет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность антител.

История создания метода

Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с узкойспецифичностью. Так, при определенных условиях иммунизации бактериальнымиполисахаридами удается получить высокогомогенный аппарат антител с узкойспецифичностью. Кроме того, возможно слияние плазмацитомы (опухоли, возникшей изантителообразующей клетки или ее предшественника) с клетками селезенкииммунизированного животного, получив таким образом гибридные клетки(гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток способность неограниченноразмножаться, а от клеток селезенки – синтезировать антитела предопределеннойспецифичности.

Предпосылками для возникновения метода получения гибридом, синтезирующихмоноклональные антитела, были разработки двух методологических подходов:

1)   получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне организма;

2)   метод соматической гибридизации клеток.

У мышей довольно легко получить миеломы (плазмацитомы). Эти опухолиявляются потомками одной клетки (то есть имеют моноклональное происхождение) исекретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из которых могутвзаимодействовать с известными антигенами. Опухоли индуцируют у животных путемвнутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика.Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус животного,и только у двух линий инбредных мышей экспериментаторам удалось получить такиеопухоли.

Миеломные клетки мыши оказались чрезвычайно удобными для изучениябиохимии продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для пониманияструктуры, механизмов секреции и их функции. Однако, миеломная система какисточник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей –не удавалось иммунизировать животных, а затем получить мышиные миеломы,продуцирующие антитела к иммунизирующие антигену. Из тысяч миеломных опухолей,индуцированных у мышей, лишь единичные вырабатывали иммуноглобулины, которыереагировали с известными антигенами, что было обнаружено путем грубогоскринирования с множеством потенциальных антигенов. Таким образом, миеломныебелки оказывались с неизвестной антигенной специфичностью.

Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явиласьтехника гибридизации соматических клеток, разработка которых широко проводиласьпосле открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматическихмембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер –гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро снабором хромосом от всех слившихся партнеров – образуется гибридная клетка.Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить, использовав рядагентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль.

Даже при использовании агентов, повышающих слияние, частота образующихсягибридов крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды,позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее времяразработано несколько принципов селекции гибридных клеток. Одним из наиболеераспространенных является метод, основанный на применении системы, содержащейгипоксантин, амидоптерин и тимидин (система ГАТ).

Селекция гибридных клеток основана на том, что в ГАТ среде родительскиемиеломные клетки погибают, а нормальные клетки селезенки не обладаютспособностью расти при данных условиях культивирования, так что выживают иразмножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клетокспособность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себяследующие этапы:

ﭼ   иммунизация животных;

ﭼ   подготовка клеток к слиянию;

ﭼ   слияние;

ﭼ   отбор индуцирующих специфические антитела клонов;

ﭼ   клонирование и реклонирование;

ﭼ   массовая наработка гибридомных клеток;

ﭼ   получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;

ﭼ   выделение антител.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизациидо выделения антител занимает  3-4 месяца.

Организация работы и оборудование. Для работыпо получению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Экспериментможно проводить и в части большой комнаты, максимально удаленной от входнойдвери. Это помещение надо оснастить следующим оборудованием:

1.   Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильноговоздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицыкрупнее 0,3 мкм.

2.   Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температураи концентрация СО2.

3.   Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно сохлаждением.

4.   Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.

5.   Холодильник на +4 и на –200С.

6.   Водяная баня на +37 и +560С.

Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридомнужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луночныепланшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75см2 и др., пластиковую посуду для проведения иммуноферментного ирадиоиммунологического анализов, среды для культивирования, необходимыереактивы, сыворотку плода коровы (СПК).

Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Основнымисредами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640  и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются идругие среды, в частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаютсяв виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшиерезультаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухихпорошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Дляприготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевойпосуде вода.

Выбор экспериментального животного. Обычно для иммунизациииспользуют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышейи крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращиваниеполученных гибридом в организме этих животных.

Другие животных практически не используются.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенныедетерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняетотбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте,так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности дляиммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапахиммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной техники и является какраз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можнополучить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употребиввпоследствии эти антитела для очистки антигена.

Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации состоит втом, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданнойспецифичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при которомони способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки.Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы выделятьселезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего введенияантигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активнопролиферирующих клеток.

Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и егоиммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами,тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В последнем случаенеобходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Средиадъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ).Помимо этого, используют введение антигена, преципитированного на квасцах, ивведение вместе с антигеном убитых клеток BordetellaPertussis. Обычно антиген вводятнеоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотячрезмерная иммунизация может иметь обратный эффект – отмечено, что иногда уклеток гипериммунизированных животных снижается способность образовыватьгибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.

По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену  (титрантител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степеньиммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной).Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт набирают животных свысоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов гибридизации,если при иммунизации животных нет образования антител или они образуются внизком титре.

Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схемуиммунизации.

1.   Вводят 1-100 мкг антигена в ПАФ или в виде преципитата на квасцахвнутрибрюшинно. Если есть возможность, то одновременно вводят 2*109 убитыхклеток B. Pertussis.

2.   Через 2-3 недели вводят антиген на физиологическом растворевнутрибрюшинно или внутривенно. Эту процедуру можно повторять до появлениявысокого титра антител.

3.   Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 суток животныезабиваются, и готовится суспензия клеток для гибридизации.

При применении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки,чужеродные клетки крови, бактерии, паразиты и т.д.) делают несколько инъекцийбез адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2-3 недели по (1-5)*107клеток. Последнюю инъекцию делают внутривенно и через 3 дня выделяют клеткиселезенки для гибридизации.

В последнее время активно развиваются  методы полной иммунизации внеорганизма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет рядсущественных преимуществ:

a)  укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;

b)  требуется существенно меньшее количество антигена;

c)  ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ(частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);

d)  повышается процент отвечающих клеток;

e)  легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.

Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух системахкультивирования лимфоцитов, разработанных в конце 1960-х годов. Методсуспензионного культивирования был первым методом, в котором иммунизацияполностью проходила вне организма. Критическими факторами в данном методе былинизкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), высокая плотность клеток,легкое покачивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и выборподходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана).

Другой основной системой иммунизации in vitro является метод Д.Марбрука. Клетки культивируют в маленькой камере на диализной мембране, черезкоторую идет обмен средой из большого резервуара.

Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является доля IgM-образующихклонов. Это связано с тем, что при иммунизации in vivo клетки берут вовремя вторичного иммунного ответа, при котором образуются в основном антитела IgGкласса, тогда как in vitro реакция идет по первичному типу, для которогохарактерна продукция IgM антител. Эта проблема может быть преодолена послеотработки способов получения вторичного иммунного ответа in vitro.

Существуютдва основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первыйметода заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГпри 370 С с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляютдо 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клеткицентрифугируют и ресуспендируют  в среде культивирования.

Вовтором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. Косадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5-7 мин. Затем ихразводят в большом объеме среды с сывороткой, обмывают и культивируют.

Клонированиегибридомных клеток

Клонированиеосуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавнообразованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная сутратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшиеспособность продуцировать антитела и они могут перерастать антителообразующиегибридные клетки.

Косновным методам клонирования клеток относятся клонирование методомлимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование спомощью прибора – проточного цитофлуориметра.

Клонированиеметодом лимитирующих разведений. Если клетки посеяны в 96-луночные планшетыочень редко, то доля лунок, в которой наблюдается рост клеток, подчиняетсяраспределению Пуассона:

/>

где f(0) – фракция лунок, в которых отсутствует рост; l – среднее число клеток на лунку.

При l = 1  f (0) = 0,37. Для того, чтобыполучить разумную вероятность только одного клона в лунке, в более 37% лунок недолжно наблюдаться роста клеток. Поскольку эффективность клонирования редкобывает равной 100%, клетки необходимо засевать при плотности 10, 3 и 0,5 клетокна лунку. В тех планшетах, на которых наблюдается рост в половине лунок,содержатся изолированные клоны.

Припервом клонировании активной может оказаться только небольшая часть клонов.Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором доляположительных клонов будет возрастать.

Дляклонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же видыклеток, что и для начального роста гибридом.

Клонированиев полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применятьполужидкий агар. Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Нижний(твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему даютзатвердеть. Затем добавляют второй слой – мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, вкоторый включаются клонируемые клетки. При использовании клеток питающего слояих засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивированияудаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара.

Колониистановятся видимыми через 7-14 суток, их переносят на жидкую культуру.

Клонированиес помощью проточного цитофлуориметра. Приготавливают флуоресцентныемикрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются наантигенспецифических гибридомных клетках, что позволяет выделять их на этомприборе.

Послевыделения тем или иным способом положительных клонов, клетки этих клонов размножаютв достаточном количестве и образцы их замораживаются.

Массоваянаработка моноклональных антител

Послеотбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела,можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения больших количествмоноклональных антител. В начале культивирования гибридомные клетки могут растимедленно и плохо переносить низкую плотность посева. В связи с этим припересеве клеток их надо разводить не более чем в 3-5 раз. Ускорению ростаклеток может способствовать добавление клеток питающего слоя. Гибридомныеклетки необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегатьповышения концентрации клеток выше 0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать какв стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного родакультиваторах (ферментерах).

Дляполучения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют растидо предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдаетсягибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадокотбрасывается, то есть не пытаются культивировать дальше оставшиеся живыеклетки.

Дляполучения больших количеств антител вводят гибридомные живые клетки в организмживотных и получают от них асцитную жидкость. Предварительно животным вводятагенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестветакого агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл за 10-14 суток до введенияклеток.

Очисткаантител

Длямногих целей не требуется очистка антител, и они используются в видекультуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновуюфракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммония с последующимдиализом. Если антитела необходимо выделить в чистом виде, то предварительноопределяют их класс и подкласс, так как способы очистки различаются для антителразных классов. Это можно сделать с помощью метода иммунодиффузии по Ухтерлони.

Выделениечистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах. При этом методе,однако, есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная структураклеточной поверхности.

Если неудается выделить антитела прямым способом, то получают иммуноглобулиновуюфракцию с помощью различных методов аффинной и ионообменной хроматографии насефарозес пришитым ковалентно белком А.

Заключение

Одна иззадач клеточной инженерии состоит в создании клеточных систем с новымисвойствами на основе клеточных взаимодействий. В настоящее времясовершенствуются методы иммунизации вне организма и изучаются механизмыактивации В-лимфоцитов. Это особенно важно для получения моноклональных антителчеловека.

Однимиз условий дальнейших успехов на пути получения клеток и клеточных систем сновыми свойствами является углубление знаний, касающихся фундаментальных основбиологии: механизмов регуляции процесса клеточной дифференциации, физиологиипротопластов как объекта биологической трансформации клеток, взаимоотношенийклеточных органелл. Следовательно, прогресс в развитии клеточной инженериибудет в значительной степени определяться успехами в области клеточной биологиии клеточной физиологии.