Реферат: Метод радиоавтографии в биологии

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">Реферат:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">Метод радиоавтографии

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:RU;mso-fareast-language:RU;mso-bidi-language:AR-SA">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Радиоавтография,определение, история.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Методрадиоавтографии основан на введении в исследуемый объект соединения,«меченого» радиоактивным атомом и выявлении места его включения путемфотографической регистрации излучения. Основой получения изображения являетсявоздействие ионизирующих частиц, образующихся при распаде радиоактивного атома,на ядерную фотоэмульсию, содержащую кристаллы галоидного серебра.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Открытиеметода радиоавтографии напрямую связано с открытием явления радиоактивности. В1867 году было опубликовано первое наблюдение о влиянии солей урана нагалогениды серебра (

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Niepce<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">de<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">St<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">.<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">Victor<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">). В 1896 году Генри Беккерель наблюдал засвечивание фотопластинкисолями урана без предварительной экспозиции на свету. Этот экспериментсчитается моментом открытия явления радиоактивности. Радиоавтографиюприменительно к биологическому материалу впервые использовали Лакассань иЛаттье (Lacassagne, Lattes 1924) в 20-х годах прошлого века; гистологическийблок от различных органов животных после введения им изотопов прижимали плоскойстороной к рентгеновской пластинке и экспонировали. Заранее получалигистологический срез и подвергали стандартной процедуре окраски. Полученныйавтограф изучали отдельно от среза. Этот метод позволяет оценить интенсивностьвключения изотопа в биологический образец. В сороковых годах Леблон использовалрадиоавтографию для демонстрации распределения изотопа иода в срезах щитовиднойжелезы (<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Leblond<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">C<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">.<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">P<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">. 1943).

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Первыепопытки сочетать радиоавтографию с электронной микроскопией были сделаны в 50-егоды (

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Liquir<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">-<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Milward<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">, 1956).Электронно-микроскопическая радиоавтография представляет собой частный случайобычной радиоавтографии, при котором также подсчитываются зерна серебра иучитывается их распределение. Особеннось метода состоит в применении оченьтонкого слоя эмульсии. В настоящее время достигнуто разрешение около 50 нм, чтов 10-20 раз выше в сравнении со световой микроскопией.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Внастоящее время метод радиоавтографии дополнен возможностью автоматической оценкиколичества зерен серебра с помощью видеоанализаторов. Часто для усилениясигнала метки (как правило это изотопы с высокими энергиями) применяютсяразличные виды сцинтиляторов, нанесенные на пластины (усиливающий экран сфосфорным покрытием), или импрегнированные в эмульсию (

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">PPO<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">) – в таком случае излучение фотонов засвечивает обычнуюфотопластину или фотопленку.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Фотографическийпринцип получения изображения, фотоэмульсии

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Врадиографическом исследовании роль детектора ядерных распадов выполняет фотоэмульсия,в которой при прохождении ионизирующей частицы остается скрытое изображение,выявляемое затем в процессе проявки, аналогично обработке обычной фотопленки.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Фотоэмульсияпредставлет из себя взвесь микрокристаллов галоидного серебра в желатине.Микрокристаллы имеют дефекты в структуре, называемые центрами чувствительности.Согласно модели Гэрни-Мотта эти нарушения ионной решетки кристалла способнызахватывать электроны, высвободившиеся при прохождении альфа- или бета-частицыв зоне проводимости кристалла, в результате чего ион превращается в атом.Образовавшееся скрытое изображение может быть выявлено с помощью процедуры, врезультате которой активированные кристаллы галоидного серебра превращаются взерна металлического серебра (этот процесс называется химической проявкой). Вкачестве проявителя может быть использован любой агент с достаточнойвосстанавливающей активностью (типично в фотографии и авторадиографиииспользуются метол, амидол или гидрохинон). После проявления экспонированныхкристаллов остальные микрокристаллы галоидного серебра удаляют из эмульсии припомощи фиксатора (обычно — гипосульфит). Ядерные фотоэмульсии характеризуетсяразрешающей способностью (зернистостью) и чувствительностью. Перваяопределяется размером микрокристаллов соли серебра и обратно пропорциональнапоследней. Фотоэмульсия характеризуется пониженной чувствительностью к видимомусвету, но работа с ней, тем не менее, должна производится в темноте, чтобыисключить появление артефактов.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Эмульсияможет наносится на препарат в виде готовой пленки с подложкой или погружением препарата в разогретую жидкуюэмульсию – таким образом получается тонкий равномерный слой, которыйпроявляется обычным способом. Перед нанесением эмульсии для световоймикроскопии препарат обычно окрашивают требуемой гистологической окраской, ноболее бледно, чем обычно, чтобы сделать возможным подсчет  зерен серебра на всех участках. Определенноевремя препарат экспонируют, затем проявляют.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Изотопы,используемые в радиоавтографии.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Врадиоавтографии в зависимости от целей исследования и доступных материаловвозможно применение различных изотопов. Изображение, создаваемое ионизирующейчастицей на ядерной фотоэмульсии зависит от энергии частицы и типа еевзаимодействия с веществом.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Альфа-частицы,испускаемые одинаковыми радиоактивными ядрами обладают одинаковой энергией (

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">E<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">) и одинаковой длиной пробега (<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">R<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">)<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">, связанными следующим соотношением:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">R = kE3/2

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Где 

<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">k<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> – <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">константа,характеризующая среду, в которой распространяются частицы. Величина пробегачастиц в серде определяется ее плотность и элементарным составом. СоотношениеБрегга-Климена позволяет по величине пробега альфа-частиц в воздухе (<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">R<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">0 <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">) оценить пробег в веществе с атомной массой <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">A<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»"> и плотностью <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">d<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">R=

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">0,0003 ( R0 / d ) A1/2

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Посколькуионизирующая способность альфа-частиц очень высока, это облегчаетфотографическую регистрацию распределения изотопа, а так же позволяетиспользовать для регистрации неэмульсионные материалы. След альфа-частиц,испускаемых одним источником, на автографах выглядит как пучок прямолинейныхотрезков, обычно длиной 15-50 мкм, исходящих из одной точки, что позволяетточно локализовать участок включения радиоактивной метки. Однако, альфа-частицыиспускаются изотопами с большими атомными номерами, что ограничиваетвозможность их применения в качестве биологической метки.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Трекиальфа-частиц часто наблюдаются в гистологических радиовтографах как артефакт –результат собственного излучения изотопов, находящихся в предметном стекле.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Бетаизлучение характеризуется непрерывным спектром начальной энергии частиц – отнуля до определенной для каждого изотопа

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">E<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">max<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">. Формы спектра существенно отличаются.Так, наиболее вероятная энергия частиц, излучаемых тритем составляет 1/7 от <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">E<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">max<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">, 14C– около ¼,  32<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">P<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»"> – около 1/3. Максимальная энергия бета-излучения различныхизотопов меняется в пределах от 18 кэВ до 3.5 МэВ – в гораздо более широкихпределах, чем альфа излучения. Как правило, максимальная энергия выше у  короткоживущих изотопов.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Прохождениебета-частиц и моноэнергетических электронов через вещество сопровождается двумяосновными типами взаимодействия. При взаимодействии с орбитальным электрономчастица может передать ему энергию, достаточную для ионизации атома (удаленияэлектрона с орбиты). В редких случаях эта энергия настолько велика, что можнонаблюдать трек освобожденного электрона. Из-за равенства масс частицы иэлектрона происходит отклонение от первоначального движения. Взаимодествиевторого типа, с атомными ядрами, приводит к возникновению тормозногорентгеновского излучения. Хотя последнее и не регистрируется эмульсией, актвзаимодейтсвия частицы с ядром может быть обнаружен по резкому изломутраектории.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Многократноевзаимодействие с орбитальными электронами приводит к искривлению траектории,которая обычно выглядит как извилистая линия, особенно в конечной части, когдаскорость частицы падает, а ионизирующая способность возрастает. Длинатраектории заметно превышает расстояние от начальной до конечной точки трека –пробег. По этой причине даже для моноэнергетических электронов характерноналичие спектра пробегов, ограниченного сверху 

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">R<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">max<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">, харакерным дляданного излучения. Из-за более низких ионизационных потерь бета частицырегистрируются с большими сложностями, чем альфа-частицы. Они не образуютсплошных треков (кроме самого мягкого излучения трития – однако в этом случаемала вероятность прохождения более чемп через один кристалл эмульсии),плотность и число проявленных кристаллов варьируют в различных пределах. Пробегбета-частицы в другом элементе может быть оценен по формуле:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">R = RA1 (Z/A)A1/(Z/A)

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Вшироком диапазоне значений

<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Emax<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">максимальныйпробег связан с максимальной энергией соотношением:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Rm =

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">412<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US"> Emax1.265– 0,0954 ln Emax

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Различиев пробегах, ионизационной способности и плотности проявленных эмульсионныхкристаллов у частиц с различной энергией может быть использовано длядискриминации распределения элементов, эсли их изотопы существенно отличаютсяпо

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">E<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">max<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">, как в случае стритием и 14С. Дискриминацию распределения двух изотоповосуществляют с помощью нанесения на образец двух эмульсионных слоев,  первый слой регистрирует преимущественномягкое излучение, второй – жесткое. Согласно некоторым работам различныеизотопы могут быть надежно выделены по размеру проявленных эмульсионных кристаллов-  кристаллы, затронутые бета-частицейтрития, обладающей большей ионизационной способностью, имеют большие размеры.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Электроны внутренней конверсии образуются припоглощении гамма кванта с очень низкой энергией излучения и удалении электронас внутренней оболочки атома. Эти электроны подобны мягким бета-частицам, но вотличие от последних являются моноэнергетическими. Наличие  электронов внутренней конверсии позволяетиспользовать такие изотопы как 125

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">I<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Внастоящее время чаще всего используются изотопы, излучающие бета-частицы. Какправило для метки в гистологических исследованиях используется тритий. Первыеавтографы с использование трития были изготовлены еще в 50-е годы (

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">Fitzgerald<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">et<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">al<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">. 1951), однако широкое его применение началось после того, как вБрукхэвенской лаборатории был получен меченый тритием тимидин. Посколькуводород входит в состав всех органических веществ, то, используя тритий, можнополучать самые разные соединения, несущие радиоактивную метку. Чем меньшеэнергия испускаемой частицы, тем короче трек, оставляемый ей при движении вфотоэмульсии и тем точнее можно локализовать расположение меченого атома. Длинапробега бета-частиц трития около 1-2 мкм, наиболее вероятная энергия 0,005 МэВ,а трек состоит в большинстве случаев из одного зерна серебра, что позволяет локализоватьисточник излучения не только в относительно крупных клеточных структурах, такихкак ядро, но и в отдельных хромосомах.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Введение «меченых» метаболитов ворганизм позволяет проследить включение изотопа в клетки тканей животного, чтодает возможность исследовать самые разные биохимические процессы в живоморганизме.           

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Получение абсолютных данных – концентрациимеченого вещества в изучаемом объекте редко бывает целью радиоавтографическогоисследования, для этого необходимо знание ряда условий, определение которыхзатруднено. Поэтому количественные радиоавтографические исследования обычнопроводят путем сравнения концентрации зерен серебра над исследуемым объектом иконтролем, при этом контрольные данные удобно принимать за единицу, или 100%.

Характеристики некоторыхизотопов, используемых

в радиоавтографиибиологических объектов

Изтоп

Период полураспада

Частица

Максимальная энергия излучения

3H

12.35 лет

<span Times New Roman";mso-hansi-font-family: «Times New Roman»;mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family: Symbol">b

-

0.019 МэВ

14C

5730 лет

<span Times New Roman";mso-hansi-font-family: «Times New Roman»;mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family: Symbol">b

-

0.155 МэВ

35S

87.4 дня

<span Times New Roman";mso-hansi-font-family: «Times New Roman»;mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family: Symbol">b

-

0.176 МэВ

32P

14.3 дня

<span Times New Roman";mso-hansi-font-family: «Times New Roman»;mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family: Symbol">b

-

1.709 МэВ

45Ca

164 дня

<span Times New Roman";mso-hansi-font-family: «Times New Roman»;mso-ansi-language:EN-US;mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family: Symbol">b

-

0.250 МэВ

Бета-частицырадиоактивного фосфора способны пролетать в ядерной эмульсии расстояния донескольких миллиметров, трек состоит из десятков редко расположенных частицсеребра – так, радиоактивный фосфор может быть использовани только для изученияраспределения изотопа в тканях, локализацию в отдельных клеточных структурахустановить невозможно.

 Радиоактивные сера и углерод могут бытьиспользованы для локализации изотопа в отдельных клетках, при условии того, чтоони крупные или расположены на достаточном расстоянии друг от друга, что можетбыть достигнуто в мазках крови или клеточных суспензиях.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Разрешающаяспособность и погрешности метода, ошибки метода.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Под разрешающейспособностью понимают степень точности с которой можно определить локализацию впрепарате радиоактивного вещества («метки»). Разрешающая способность метода вданном случае ограничена двумя факторами.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Геометрическая ошибка – в связи с тем,что испускаемая частица может быть направлена под любым углом к поверхности фотослоя.Следовательно, зерно серебра в фотослое может быть расположено не точно надрадиоактивным атомом, а более или менее смещено в зависимости от направлениядвижения частицы и длины пробега (энергии).

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Фотоошибка возникает в связи с тем, чтозерно серебра, состоящее из тысяч атомов металла намного больше, чемрадиоактивный атом. Таким образом, о локализации меньшего объекта приходитсясудить исходя из положения большего.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Прииспользовании трития, характеризующегося малой энергией (пробегом) испускаемыхчастиц и ядерных фотоэмульсий с низкой зернистостью разрешающая способностьметода радиоавтографии лежит в пределах разрешающей способности оптическихсистем – 1 мкм. Таким образом, эти ошибки не имеют существенного влияния наполучаемый результат.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Для достижения лучшего разрешения необходимоуменьшать  толщину среза, слоя эмульсии ирасстояние между ними. Препарат следует немного недоэкспонировать.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Эффектавтоабсорбции:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">Число зерен серебра зависит от степени поглощения излученияклеточными структурами, благодаря малому пробегу и малой энергии бета-частиц,их абсорбция в тканях достаточно велика, что может приводить к потере метки,поэтому важное значение приобретает вопрос о толщине срезов. Показано, чточисло зерен серебра пропорционально радиоактивности ткани только при толщинесреза не более 5 мк. <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Относительноечисло бета-частиц, прошедших сквозь слой поглотителя толщиной х можетбыть оценено по закону Бэра –

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">Nx/N0= e -

<span Times New Roman";mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-hansi-font-family:«Times New Roman»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»; mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family:Symbol">m<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US"> x<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Где

<span Times New Roman";mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-hansi-font-family:«Times New Roman»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»; mso-char-type:symbol;mso-symbol-font-family:Symbol">m<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">- коэффициент поглощения (величина,обратная толщине слоя, при прохождении которого число частиц уменьшается в <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">e<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»"> раз. Величину коэффициента поглощения можно приближенно оценитьпо величине <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Rm<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> (максимальный пробег), известной для всехизотопов, с помощью соотношения <span Times New Roman";mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-hansi-font-family: «Times New Roman»;mso-bidi-font-family:«Times New Roman»;mso-char-type:symbol; mso-symbol-font-family:Symbol">m<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»"> <span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">Rm<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> = 10, справедливого для не слишкомжестких излучений.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Если в слоеединичной толщины в единицу времени возникает

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">n<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»"> частиц, движущихся к поверхности, то в образце толщиной хповерхности достигнет <span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language:EN-US">N<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> частиц:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»; mso-ansi-language:EN-US">N = <img src="/cache/referats/19755/image002.gif" v:shapes="_x0000_i1025">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Фон и артефакты:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»"> Ошибку визмерения могут вносить так же механические воздействия – царапины, трещиныэмульсии, ведущие к образованию скрытого изображения и фоновое излучение,которое необходимо учитывать при обработке радиоавтографов. Фон учитываютподсчетом числа зерен серебра на пустом участке препарата. Ошибки так жевносятся в результате гистологической обработки срезов – проводки по спиртам(дегидратации), заключения в парафин, окраски. Эти процедуры могут влиять наразмеры и соотношения клеточных структур.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">Радиационныйэффект меченых метаболитов:

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">  Благодаря малой энергииизлучения тритий вызывает в клетке значительную ионизацию, намного превышающуюрадиационный эффект бета-частиц углерода. Вследствие этого при продолжительномдействии меченого соединения например 3<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»;mso-ansi-language: EN-US">H<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family: «MS Mincho»">-тимидина происходит разрушение и гибель клеток, приводящие к остановкероста тканей. В первую очередь нарушается сперматогенез. Имеются данные омутагенном и канцерогенном действии меченых метаболитов. Наблюдаемыецитологические изменения заключаются в нарушении прохождения клеткамимитотического цикла, изменении плоидности клеток и появлении хромосомныхаберраций. Но, по-видимому, повреждающее действие изотопа на клетки мождетзаметным образом сказываться на результатах исследования лишь в условияхдлительного эксперимента.

<span Times New Roman",«serif»;mso-fareast-font-family:«MS Mincho»">

Количественная оценка радиоактивности

Как правило, в эксперименте определяют не абсолютное, аотносительное количество включившегося изотопа. Степень включения метки можнооценить двумя способами – денситометрически – что более применимо кмакроавтографам и прямым подсчетом зерен серебра над объектами. Эта трудоемкаяпроцедура в настоящее время может быть выполнена с помощью компьютера. Цифровойснимок гистологического препарата обрабатывается специальным програмнымобеспечением, с целью автоматически выделить на нем клетки и клеточныеструктуры и подсчитать косличество зерен серебра. Если встает вопрос околичественной оценке – необходимо привлекать понятие эффективности. Чаще всегопод эффективностью понимают число зерен серебра, образующихся при регистрацииодного радиоактивного распада. На эффективность метода влияют многие факторы, впервую очередь толщина объекта и эмульсии.

Висследованиях с помощью сцинтиляционного счетчика была найдена высокаякорреляция между средним числом распадов в минуту и количсетвом зерен серебра.По данным Ханта (Hunt, Foote, 1967) образованиеодного зерна в применявшейся в эксперименте эмульсии соответствует 5.8радиоактивных распадов, т.е эффективность метода составляет 17.8%.

Дляколичественной оценки трития в макроскопических препаратах могут бытьиспользованы образцы со стандартной активностью, которые монтируются на том жеавтографе.

Точнаоценка радиоактивности сравниваемых биологических объектов очень сложна.

Примерыисследований методом авторадиографии

Классическийпример радиоавтографического исследования – это работа по изучению накопления 32P в ДНК клеток корня конскогобоба (Howard, Pelc, 1953). В этомэксперименте было впервые показано деление митотического цикла на четырепериода (митоз — M, G1 — пресинтетический период,S – синтез ДНК, премитотический период G2), что  период синтеза ДНК  занимает ограниченную часть интерфазы, будучиотделен во времени от начала и окончания митоза. Данные Говард и Пелка позднеенашли подтверждение в более точных экспериментах с применением спецефическогопредшественника ДНК – 3H-тимидина.<span MS Mincho"">

<span MS Mincho"">Методы оценки синтеза белка.Наиболее распространенными предшественниками для оценки общего белковогосинтеза в радиоавтографических исследованиях служат 3

<span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">H<span MS Mincho"">-лейцин, 3<span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">H<span MS Mincho"">-метионин, 3<span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">H<span MS Mincho"">-фенилаланин. Например, сиспользованием  лейциновой метки изучалсясинтез общего белка в головном мозге крыс первых недель постнатального развития(<span MS Mincho";mso-ansi-language: EN-US">Pavlik<span MS Mincho"">, <span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">Jakoubek<span MS Mincho"">, 1976).  Для изучения синтеза гистонов и их влияния нарегуляцию транскрипции используют основные аминокислоты 3<span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">H<span MS Mincho"">-лизин и 3<span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">H<span MS Mincho"">-аргинин, для изучения синтезакислых белков — 3<span MS Mincho";mso-ansi-language:EN-US">H<span MS Mincho"">-триптофан. Плотность включения аминокислотной метки соответствуетинтенсивности синтеза белка, а следовательно отражает функциональнуюактивность  нейрона. Радиоавтографическийметод позволяет сравнивать особенности синтеза белка в различных тканяхживотных при экспериментальном воздействии, позволяет проследить динамикуизменений на уровне отдельных типов клеток и клеточных структур (ядро, телоклетки,  отростки нейрона – аксональныйтранспорт).

Радиоавтографическимметодом также были получены данные о полуконсервативном механизме редупликациихромосом, асинхронность синтеза ДНК в разных участках хромосомы, изучениеорганизации хромосом.

Внастоящее время радиоавтографический метод часто используется для изучениямозга в работах с использованием радиолигандов к определенным рецепторам. Такимобразом построены карты распределения различных рецепторов в структурах мозгаживотных и человека.

Радиоавтографическийметод также используется для визуализации гелей в биохимии и в сочетании симмунологическими методами (РИА).

<span Times New Roman",«serif»; mso-fareast-font-family:«Times New Roman»;mso-ansi-language:RU;mso-fareast-language: RU;mso-bidi-language:AR-SA">

Использованнаялитература:

1.ЕпифановаО.И. и др. Радиоавтография М., «Высш.школа», 1977

2.СаркисовД.С. Перов Ю.Л. Микроскопическая техника М.: «Медицина», 1996

3.Rogers A.W. Practicalautoradiography, Amersham UK, 1982

4.БокштейнС.З. Гинзбург С.С. и др. Электронно-микроскопическая авторадиография вметалловедении М., «Металлургия»

еще рефераты
Еще работы по биологии