Реферат: Интерстициальные клетки Кэйждела
Избирательноеповреждение интерстициальных клеток Кэйждела (ИКК) метиленовым синим и светомведёт к потере медленных волн.
Инкубация в 50 ммоль метиленовогосинего (МС) и последующая интенсивная иллюминация приводит к исчезновениюактивности медленных волн в ИКК подмышечного слоя циркулярных мышц в препаратах толстого кишечникасобак. Это часто сопровождается снижением потенциала покоя мембран.Реполяризация клетки к исходным –70мВ не восстанавливает активность медленныхволн, что указывает на то, что МС непосредственно прерывает образованиемедленных волн. После инкубации МС, 2-х минутная иллюминация изменяетконформацию митохондрий в ИКК от очень конденсированной до ортодоксальной, безиндуцирования каких-либо других видимых изменений в гладкомышечных клетках.После 4-10 минутной иллюминации, ИККначинают прогредиентно разрушаться увеличенными и разорванными митохондриями,теряют цитоплазматическую контрастность и детальность, появляются разрывыплазматических мембран. В то же время не выявляются повреждения вгладкомышечных и нервных клетках. Ультраструктура соединительных щелейсохраняется. Интенсивная иллюминация без преинкубации МС приводит к утрате медленных волн, при этом ненарушается ультраструктура в препаратах ИКК. В препаратах гладких мышц, безподмышечного слоя ИКК, МС и свет не изменяют электрической активности. Авторысчитают, что корреляция между избирательным повреждением подмышечных ИКК иизбирательной утратой активности медленных волн указывает на то, что ИКК играютнезаменимую роль в генерации медленных волн.
Концепция регуляторной роли интерстициальных клеток Кэйджела вфункционировании желудочнокишечного тракта (ЖКТ) впервые была выдвинута Stach в 1972 (30), Duchonet al.В 1974 (6), и Faussone-Pellegrini в 1977 (9). И только в 1982 году была выдвинутагипотеза – ИКК играют роль в генерации ауторитмичности ЖКТ (Thunberg). Очевидностьтого, что ИКК способствуют генерации активности синусового узла ипоследующей генерации медленных волн было установлено на ряде тканей, включаятонкий кишечник и толстый кишечник. Важно и то, что ИКК обнаруживаются в техобластях (подмышечные сплетения толстого кишечника), где образуются медленныеволны.
Втолстом кишечнике собак, очевидность роли ИКК в генерации активности синусовогоузла вытекает из следующего:
<span Times New Roman"">1.<span Times New Roman"">
Когда сети ИККудаляются, слой циркулярных мышц (ЦМ) не может генерировать активностьмедленных волн<span Times New Roman"">2.<span Times New Roman"">
В очень тонкихпрепаратах, состоящих из сети ИКК и связанных с ними гладкомышечных клеток,постоянно записываются спонтанные медленные волны.Авторы показали, что электрическая активность записаннаяна поверхности подмышечного слоя – следствие электрического взаимодействия между телом ЦМ и подмышечной сетью ИКК вместе с гладкомышечными клетками(ГМК). В результате излишних пар ИКК к ГМК с помощью соединительных щелей, роль каждого типа клеток в генерациимедленных волн не может быть определена точно в электрофизиологическихисследованиях с применением изолированных мышечных лоскутов.
Допоявления электронной микроскопии, большинство селективных методов дляраспознования ИКК основывались на способности последних аккумулироватькраситель МС вне физиологических условий. Взависимости от условий МС можетпервично связываться ИКК или нервной тканью. В пршлом идентификация ИКК с использованием прижизненногоокрашивания МС применялась только на тонком кишечнике мышей, гвинейских свинейи кроликов. В свежих публикациях, авторы демонстрируют способность аккумуляцииИКК толстого кишечника собак. В том же исследовании, авторы показали, что в подавленном свете МС не вызываетизменений ультраструктур в окрашенных ИКК и знчительно не изменяет медленныхволн.
Впредварительном исследовании, авторывыяснили, что активность медленных волн тонкого кишечника мышей исчезает,когда селективно окрашенные ИКК освещаются. Более того, иллюминация МС-окрашенных ИКК в культурируемыхкусочках тонкого кишечника мышей приводила к потере спонтанной ритмичнойконтрактильной активности, это эффект был обратимым на короткий период прииллюминации низкой интенсивности, но необратимым в других случаях.
Задачей авторов было обнаружить метод специфического повреждения ИККтолстого кишечника собак. Фототоксические свойства МС использовались дляизучения вероятных эффектов на активность медленных волн и измененияультраструктуры различных типов клеток связанных с подмышечной сетью ИКК.
МЕТОДЫ.
Ткани и препараты.
Собакиобоих полов были убиты передозировкой калиевой соли фенобарбитала (100 мг/кг). Примерно 5 смпроксимального отдела толстой кишки было взято от каждой собаки, отступя 5 смдистальнее от илеоцекального сочленения. Затем толстый кишечник вскрывалсяпродольным разрезом. Затем очищенный сегмент прикреплялся ко дну диссекционнойчаши Сильгарда наполненной постоянно оксигенированным (95% кислорода и 5% СО2)раствором Кребса.
Чтобыизучить специфичность действия МС и света, авторы исследовали действия МС исвета и на препаратах ИКК-ЦМ (подмышечная сеть ИКК и ЦК) и на препаратах ЦМ(ЦМ, отделённые от подмышечного слоя ИКК и гладкомышечных клеток.
Примерно 2 кв.мм. Ткани, с подмышечной поверхностью, обращённой вверх прикреплялся кодну переносного держатель. Затем тканбыла разрезана вдоль прикреплённых краёв, исключая один край, где была вырезанаполоса длиной 10 мм, шириной 3 мм вдоль длинной оси ЦМ клеток. Свободный конецполосы был взят на хирургический шёлк (0,5 мм в диам). Держатель перемещали в разделённую камерупричём прикреплённую ткань – в записывающую камеру, свободный конец в стимулирующуюкамеру. Свободный конец также соединяли с сильным преобразователем.
Лекарства ирастворы.
Все растворы вводимы в раздельную камеру были нагреты до37 гр и оксигенированы кислородом 95% — СО205%. Состав раствора Кребса былтакой: 120,3 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2MgCl2, 20,2 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 и 11,5 глюкозы. МС (сигма) былрасстворён в растворе Кребса.
Внутриклеточныезаписи.
Внутриклеточные записи были сделаны микроэлектродамиимевшими пиковое сопротивление 30-50 ом. Микроэлектроды были заполнены 3 М KCl. Заполненные микроэлектродыподключались к держателю соединённому с электрометром. Данные электрометраотражались на осцилоскопе и записывались на принтер. Электрические импульсыподавались на мышечный лоскут. Сила электрического поля отражалась наосцилоскопе и записывалась на принтере. Мышечные лоскуты подлежащие воздействиюимпульсами продолжительно оксигенировались раствором Кребса с частотой 500 мл/час в разделительной камерекак минимум 2 часа при температуре 37 град перед началом эксперимента.
Во времяинкубации МС (50 ммоль) интенсивность света была низкой. Затем препараты мылисьраствором Кребса примерно 5 минут. Препараты иллюминировались оптическимиволоконными лампами (максимальная интенсивность составила 50 мВ/кв.см. поверхности тканиудалённой от источника света на 3,5 см). интенсивность света измерялась цифровым фотометром. После эксперимента лоскуты немедленно помещали вформалин.
Световая иэлектронная микроскопия.
После экспериментальной процедуры Сильгард отделяли отдержателя с тканью, фиксированной формалином.Лоскуты хранились при температуре 4 град. Каждый лоскут делили на 4-6 кусочковткани. Перед дальнейшей процедурой степень связывания МС определяласьстереомикроскопией. Затем ткань мылась 0,1 м фосфатным буфером, фиксировалась2% осмической кислотой в 0,1 М фосфатном буфере в течении 1 часа. Ультратонкиеобразцы фиксировались спиртовым ацетатом мочевой кислоты и исследовались вэлектронном микроскопе.
Статистическийанализ.
Статистическая значимость данных внезависимости от различных условий была установлена Student’s тестом.
Результаты.
Электрофизиологическиеисследования.
Эффектысвета на МС окрашенные ИКК-ЦМ препараты. Инкубация ИКК-ЦМ препаратов в50 ммоль МС + 45 мин деполяризация клеток повышают продолжительность медленных волн. Чтобы уменьшитьнеспецифические экстрацеллюларные эффекты МС вовремя иллюминации, ткань мыласьраствором Кребса. Во время этого устранялись эффекты МС на активность медленныхволн. Эта часть эксперимента выполнялась в подавленном свете.
Послеинкубации в ИМС и мытья интенсивная иллюминация упраздняла активность в ИКК-ЦМпрепаратах. Упразднение меделнных волн сопровождалась деполяризацией клеток кмембранному потенциалу –47 мВ (колебания от –64 мВ до –42мВ). Совместно этомуисчезли фазовые сокращения и тонус лоскута повысился. Активность медленных волнне поражалась, когда ИКК-ЦМ препараты иллюминировались с максимальнойинтенсивностью в течениии 10 минут без предварительной инкубации в МС.
Упразднениемедленных волн не было прямым эффектом деполяризации с того момента, какреполяризация не восстанавливала активность медленных волн, даже когдареполяризация применялась до того, как амплитуда медленных волн полностьюуменьшалась. Эти наблюдения указывают на то, что эффекты МС и света на механизмгенерации активности медленных волн не зависят от мембранного потенциала. Впротивоположность этому изменения активности медленных волн, вызванныеповышением внеклеточной концентрации калия зависят исключительно от деполяризации, как только реполяризациямышечных лоскутов полностью обратит эффекты. Кроме этого, упразднениеактивности медленных волн может быть обнаружено при деполяризации лишьпотенциалом 8-12 мВ (медленные волны упраздняются при величинах мембранныхпотенциалов –60,4 мВ) .
Скорость, с которой упразднялись медленные волны варьироваланепосредственно с интенсивностью света. При иллюминации с максимальнойинтенсивностью, медленные волны исчезают в пределах 0,8-3 минут. Уменьшениеинтенсивности света повышает продолжительность промежутка исчезновениямедленных волн до 3-12 минут.
Времянеобходимое для исчезновения медленных волн также зависит от длительностиинкубации в МС. Когда препараты ИКК-ЦМ инкубировались в МС в течении 7 минут споследующим периодом прмывки 5 минут, иллюминация с максимальной интенсивностьюустраняла медленные волны через 4-8 минут (n=5). Эффекты МС и света были необратимы.
ЭффектыМС и света на ЦМ препараты: Специфичность действия МС изучалась сиспользованием ЦМ препаратов, которые не содержат подмышечной сети ИКК.Инкубация в МС в течении 45 минут не вызывала эффектов на электрическихпараметрах препаратов ЦМ, находящихся впокое (мембранный потенциал покоя=-62,8 мВ), так же не было эффектов прииллюминации с максимальной интенсивностью в течении 6 минут (n=4), что было вдвое большемаксимального количества времени, требуемого для упразднения медленных волн вИКК-ЦМ препаратах в тех же условиях.
Принимаяво внимание тот факт, что способность препаратов ИКК-ЦМ к генерации медленныхволн была избирательно устранена МС исветом, подобная активность ЦМ препаратов не была устранена. После обработки МСи светом и промывки раствором Кребса, добавление BaCl2 (0,5 мМ) и BAY K 8644 (0,1мМ) снижает мембранный потенциал покоя до –46,1 мВ и вызывает появлениешипоподобых потенциалов с частотой,амплитудой и длительностью соответственно:18,7 циклов/мин; 16,5 мВ; 1,6 с. Частотапотенциалов действия была снижена, когда клетки были реполяризованы потенциаломвеличиной 8-12 мВ и полностьюупразднялась реполяризацией клеток к той же величине потенциала покоя каким онбыл в растворе Кребса. Эти наблюдениябыли типичны для ЦМ препаратов в присутствии BaCl2 иBAY K 8644.
Структурная корреляция.
Световаямикроскопия. Инкубация в 50 ммоль МС в течении 7 минут не вызывала видимоговпитывания красителя лоскутами (n=12),в то же время 45 минутная инкубация приводила к отчётливому окрашиванию всехлоскутов (n=1-). Этиобразцы были отчётливы особенно в участках, где резидуальный подслизистый слойбыл очень тонким. В первых экспериментах авторы установили полную утратуокрашиваемых ИКК, когда внутрення поверхность ЦМ слоя была извлечена изпрепарата вместе с подслизистой соединительной тканью. Вот почему во всехэкспериментах, субмукоза была отделена как можно полнее ножницами, сминимальным механическим растяжением.
После 45минутной инкубации МС окрашивание было также обнаружено кроме ИКК и небольшогоколичества аксонов, в эритроцитах внутрикапилляров и венул, в тучных клетках в субмукозе и в интерстиции ЦМ.Гладкомышечные клетки не окрашивались. В 1мм срезах ЦМ были контрастны во всехМС окрашенных лоскутов, что определялось недостаточным количеством клеток.Ткани хорошо сохранялись. ХотяИКК-ЦМ препараты, которые были преинкубированы МСв течении 7 минут не показали видимого окрашивания, контрастность подмышечногоИКК слоя уменьшалась после иллюминации с максимальныой интенсивностью в течении4010 минут как было установлено в случае окрашивания толуидином синим. Этинаблюдения коррелировали с ультраструктурными изменениями.
Электроннаямикроскопия: Контрольные данные– иллюминация без МС никаких ультраструктурных изменений не было обнаружено вИКК-ЦМ препаратах (n=11,2-10 мин иллюминация), которые освещались в течении 10 минут с максимальнойинтенсивностью без инкубации в МС. Три типа клеток, интимно связанных щелевымисоединениями и промежеуточными контактами присутствовали вдоль всеговнутреннего края препаратов. ИКК соединяются с тонкими ветвистымигладкомышечными клетками (ВКМК), которые в свою очередь формируют щелевыеконтакты и межуточные соединения с глубоко лежащими крупными клетками ЦМ.
Взаимодействие между этими типами клеток было важным, так как авторыобнаружили, что окрашивание МС и заметное повреждение после инкубации в МС ииллюминации были ограничены для ИКК, более чем для ВГМК и типичныхгладкомышечных клеток. Хотя индивидуальный профиль клеточных отростков частобыло невозможно классифицировать, то три типа клеток могут бытьклассифицированы сравнением ядерных частиц клеток:
<span Times New Roman"">1.<span Times New Roman"">
ИКК были высоко разветвлёнными клетками с 2или 5 первичными отростками, профили клеток, которые включали ядро, в соновномтакже содержали начало 1 или 2 первичных отростков. Перинуклеарная цитоплазмамежду началом отростков была очень тонкой. В начале отростков перинуклеарная цитоплазма доминировала большойаккумуляцией митохондрий. Часть цитоплазмы была занята узлами филамент с малымительцами ассоциированными с цитоплазмой и мембраной. Когда последниесравнивались с расположением плотных телец в гладкомышечных клетках (ЦМ иВГМК), оказалось, что в цитоплазме ИКК их мало. Разбросанные микротубулы всегдаприсутствовали в перинуклеарной цитоплазме. Обширный эндоплазматическийретикулум состоял из системы переплетающихся соединённых между собой цистерн,организованных частично между и вокруг митохондрий, частично соединённых стонкими цистернами. Цистерны были преимущественно тонкого типа, с грубойчастью, характеризуемой широко разбросанными рибосомами.<span Times New Roman"">2.<span Times New Roman"">
Хотя могут обнаруживаться некоторые вариацииультраструктур при осмотре полусерийных срезов, профили больших отростков трёх типов клеток в общеммогут быть классифицированы по критериям перечисленным выше.
Ультраструктурапосле инкубации в МС.
Целостная структура клеток и субклеточныедетали не поражались МС как указывалось прежде. После 7 минутной инкубации вМС, во всех 3 типах клеток не обнаруживалось каких-либо изменений. Единственнымпостоянным изменением, наблюдавшимся во всех препаратах был переход митохондрий от конденсированной(расширенные внутрикристовые пространства и плотный матрикс) к ортодоксальнойконформации (узкие кристы и разреженный матрикс) в ИКК. В противоположность этому, у гладкомышечныхклеток митохондрии находились в различной конформации до и после обработки МС исветом. Никаких доказательств в пользу конформации митохондрий в гладкомышечныхклетках (ГКМ) получено не было.
После инкубации в МСиллюминация в течении 4 и 10 минутвызывала серьёзные повреждения в ИКК и малом количестве ГКМ разбросанных покраю подмышечного слоя. После 4 минутнойиллюминации самыми выдающимися изменениями в ИКК были увеличение митохондрий иувеличение вакуолизации цитоплазмы (n=3). После 10 минутиллюминации (n=3,фотографии 6в) ИКК были увеличенными имели низкую контрастность цитоплазмы,отлично различимые митохондрии, несколько кавеол и отверстия в плзматическихмембранах, что вероятно говорило о её разрыве. Идентификация ИКК была возможнойблагодаря сохранению базальнойпластинки и совместно с чертами цитоплазмы (такими как число митохондрий) исохранению взаимосвязей с глубоколежащими клетками.
ОБСУЖДЕНИЕ.
Избирательноеповреждение толстокишечных ИКК метиленовым синим и светом.
Авторы установили строгуюочевидность того, что подмышечные ИККнезаменимы в генерации потенциалов действия медленных волн в ЦМ толстогокишечника собак непосредственно показав связь между избирательным повреждениемИКК и исчезновением медленных волн при этом. В свежих исследованиях авторы показали, что ИКК в подмышечном сплетенииизбирательно аккумулируют МС и что МС не вызывает каких-либо микроскопическизаметных изменений в любых типах клеток, кроме он не имеет значительногоэффекта на активность медленных волн. В настоящем исследовании авторы показали,что интенсивная иллюминация после инкубации в МС приводит к специфическому повреждению ИКК подтверждаемому элетронноймикроскопией. Более того, когда ЦМ препараты, у которых были удаленыподмышечные ИКК-ГМ сети, были инкубированы в МС с последующей иллюминацией,спонтанная и индуцируема электрическая активность не затрагивалась. Этинаблюдения указывают на то, что эффекты МС и света на ИКК-ЦМ препараты былиспецифичны только для ИКК, не связанных с ГМК.
Хотя устранение активностимедленных волн МС и светом сопровождалось деполяризацией, последняя не былаответственна за ингибирование активности медленных волн, с того момента,как реполяризация клеток к их прежнемупотенциалу покоя не восстанавливала медленные волны. Кроме того, было замечено, что медленные волныустраняютсяв большом диапозоне величин мембранных потенциалов, включая мембранный потенциал покоя, свойственныйциркулярным мышцам, что указывает на, что изменения активности медленных волнне вызваны изменениями величин мембранных потенциалов. В противоположностьэтому, строфантин также деполяризует мембраны и при этом устраняет активностьмедленных волн (1). Тем не менее, реполяризация мембран к изначальномупотенциалу покоя полностью восстанавливает активность медленных волн. Этоуказывает на то, что в присутствиистрофантина, ингибирование активностимедленных волн — непосредственный эффект деполяризации.
Локализация аккумуляции МС внутри ИКК очень специфична.Когда преципитация МС была проведенатак, что удалось избежать перемещения и образования грубых преципитатов былообнаружено, что электронно-плотные депозиты присутствуют только вэндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и его нет в других цитоплазматичексихкомпонентах (35). Это может указывать на то, что МС входит в ЭР непосредственнопутём проникновения через пгладкиецистерны. Тем не менее, остаётся неяснымпочему МС накапливается в ЭР ИКК, но притех же обстоятельствах не входит в ЭР ГМК. В опытных условиях настоящего исследования, изменения в конформациимитохондрий так же как активности медленных волн были обнаружены приминимальной инкубации МС в течении 7 минут и минимальнойиллюминации в течении 2 минут, что наводит на мысль о том, что первичнойпричиной устранения медленных волн является повреждение митохондрий.
Фотодинамическое цитотоксическоедействие МС было известно многие годы(2). Недавно изучалась цитотоксическая эффективность фотоинактивацииМС-чувствительных клеток рака желчного пузыря (10), включая и сопровождающие еёультраструктурные изменения (39). После короткого периода иллюминации (5минут), докладывалось, чтоультраструктурные изменения былиидентичны данным авторов (дизинтеграция митохондрий и ранние признакиповреждения плазматических мембран), а высокая продолжительность иллюминациивела к разрыву мембран клеточной фрагментации. Висследования фотодинамического действия МС на ДНК (23) было показано, что обратимые предповреждения ДНК, вызванные МС в темноте становятся необратимыми когда к инкубации вМС присоединяется иллюминация. Вот и в этом исследовании электрофизиологическиеэжффекты и ультраструктурные эффекты МС и света также были необратимыми.
РольИКК в генерации медленных волн.
Настоящее исследование подкрепляет гипотезуо том, что ИКК незаменимы для генерации активности водителя ритма в кишечнике. В подобныхисследованиях, использующих тонкий кишечние мышей иллюминация светом красного лазера устраняла внутриклеточно записанную активность медленных волн после инкубации в МС(36). Было показано, что активность медленных волн поражается в препаратах гдеИКК окрашивались МС и не поражается, где ИКК не окрашивается. В другомисследовании (37), спонтаннаясократительная активность медленных волн была сохранена, когда в культурируемыхкусочках мускулатуры тонкого кишечника мышей окрашенные МС ИКК были просмотреныпод микроскопом в очень тусклом свете, но эти кусочки быстро становилисьнеподвижными при сильном освещении.
Настоящее исследованиеспецифическиустанавливает решающую роль ИКК вгенерации медленных волн в толстом кишечнике собак как показывалось прежде(12,18,19,21,29). Авторы выдвигают гипотезу о том, что циклическая внутриклеточная активностьпериодически активирует токи водителя ритма. В этом случае ИКК могут являтьсяили биохимическими часами или одновременно биохимическими часами и ионнымиканалами, отвечающими за генерацию тока водителя ритма. Хотя спонтанные осциляции, записанные в изолированных ГМК(25) и клетках близких по описанию к ИКК (17,26), и устранялись блокаторамикальциевых каналов L-типаи следовательно не отражают медленныеволны, как компонент водителя ритма, которые в принципе этими блокаторами неустраняются (14). Таким образом, спонтанно происходящие осциляции не имеютхарактеристик медленных волн.
Следующий вопрос касается роли ГМК вгенерации медленных волн, как компонента водителя ритма. Ветвистые ГМК, которыеинтимно соединяютс с ИКК соединительными щелями представляют особый интерес. Если ИКК единственные клетки ответственныеза генерацию токо водителя ритма, то величина тока, которую каждая ИКК должнагенерировать, чтобы деполяризировать все соседствующие с ней клетки с высокимсопротивлением поверхности, должна бытьогромной. Возможно и другое: ИКК – этобиохимические часы и ИКК посылают внутриклеточные метаболиты черезсоединительные щели в интимно соединённые с ними ГМК. Благодаря такойметаболической связи (8) ассоциированные ГМК могут находиться в синхронии сИКК, когда каналы водителя ритма и в ИКК и в ассоциированных с ними ГМК –активированы. Обоснование этой части гипотезы требует идентификации каналовводителя ритма и доказательства существования таких каналов в ИКК и ГМК.Интересен тот факт, что в присутствии тетраэтил аммония, BaCl2 и карбохола, изолированный слой ЦМ безподмышечной рабочей сети ИКК-ГМК генерирует потенциалы действия, которыеидентичны по частоте с медленными волнами, но устраняются блокаторамикальциевых каналов L-типа(D-600) (18). Это ипоследующее исследование (20) показали, что ЦМ без подмышечной рабочей сетиИКК-ГМК может генерировать потенциалы с характеристиками подобными активностимедленных волн.
Активность медленных волн такжеисчезает после обработки тканейРодалином 123 в полнослойных препаратах мышц (38). Родалин 123 – специфическиймаркёр митохондрий, и таким образом он не специфичен для ИКК, хотя ИКК особеннобогаты митохондриями. После проникновения в митохондрии, Родалин 123 становитсяцитотоксичным благодаря разрушению АТФ (24). Следовательно, эффект Родолина 123 наводит на мысль о том,что активность медленных волн находится в строгой зависимости отвнутриклеточного метаболизма. Это согласуется с наблюдениями о том, чтоактивность медленных волн чувствительна к высоким температурам (1), блокируетсяингибиторами метаболизма, такими как динитрофенол и карбонил цианид (H. Preiksaitis иJ.D. Huizing,неопубликованные данные) и поражается при изменении конформации митохондрий (настоящее исследование). Этоподдерживает гипотезу авторов о том, что компонент медленных волн водителяритма образуется благодаря внутриклеточному метаболизму.
Таблицы, графики и изображения.
Таблица 1. Эффекты инкубации в50 мМ метиленового синего (45 минут) на электрическую активность препаратовИКК-ЦМ с или без иллюминации
Параметры
В растворе Кребса
+Метиленовый синий
+Свет
Мембранный потенциал покоя, мВ
-72,8+-0,8
-70,6+-0,9
-47,3+-1,9
-69,7+-1,6
Частота, циклов/минуту
5,3+-0,2
5,0+-0,2
Продолжительность, с
Амплитуда действия, мВ
3,8+-0,3
38,6+-1,4
4,9+-0,7
37,4+-1,5
Амплитуда плато, мВ
34,1+-1,3
33,2+-1,6
Частота колебаний, мВ/c
192,3+-23,8
169,4+-18,7
График 1. Электрофизиологические эффектыиллюминации на окрашенные МС препараты ИКК-ЦМ.
А: МС (45 минутная инкубация) немногоснижает мембранный потенциал покоя и увеличивает продолжительность медленныхволн. Эти эффекты исчезают после промывки препаратов от МС в растворе Кребса втечении 5 минут. Препарты затем освещались с максимальной интенсивностью. Впоследующем, амплитуда медленных волн снижалась при этом мембранный потенциал покоя уменьшался до–44мВ. Реполяризация мембран не востанавливала активность медленных волн, чтоуказывает на то, что устранение медленных волн является следствиемингибирования механизмагенерирования медленных волн и невызвана деполяризацией.
В: Уменьшение интесивности света на 1/3 от того, что было в опытеА значительно удлиняет период иллюминации, требуемый для устранения медленныхволн. В этом эксперименте наблюдались медленные волны большей продолжительностиво время периода деполяризации. Медленные волны устранялись при величинемембранного потенциала покоя –42 мВ.
График 2. Эффекты мембранного потенциала наактивность медленных волн.
А: после 45 минутной инкубации в МС ипромывки в растворе Кребса, препараты освещались с 1/3 максимума интенсивности до тех пор пока амплитудамедленных волн не станет равна половине таковой в растворе Кребса.Препараты были реполяризованы к такомуже мембранному потенциалу покоя как и в растворе Кребса. В данном случае восстановления амплитудымедленных волн не наблюдалось.
В: в противоположность этому, вслучае когда деполяризация была вызвана повышением внеклеточной концентрации К+ до 15 мМ в растворе глюкамин-нитрендипин-Кребса, реполяризация препаратов ИКК-ЦМ с использованием методаанологичному в опыте А полностью восстанавливала амплитуду медленных волн. Кроме того,амплитуда медленных волн также восстанавливалась после промывки.
Таблица 3. Устранение активности медленных волн МС+свет без заметной деполяризации. Медленные волны устранялись в МС окрашенных препаратах ИКК-ЦМ с освещением 1/3 максимумаинтесивности света на протяжении 8,5минут. Медленные волны Медленные волны устранялись при величине потенциала –64мВ, что равно истинной величине мембранного потенциала покоя препаратов циркулярных мышц в раствореКребса. (см. График 4)
Таблица 4. Электрофизиологические эффекты МС+свет напрепараты ЦМ. Препараты ЦМ,лишённые подмышечной сети ИКК и несколькихприлежащих слоёв ГМК были спонтанно помежены в раствор Кребса. Инкубация в 50 мМ МС не вызвала изменений мембранногопотенциала, чего не сделала и 3 минутная иллюминация с максимумоминтенсивности. Было показано, что препараты ЦМ жизнеспособны при стимуляции 0,5мМ BaCl2 +0,1 BAY K 8644.
Изображение 5.
А: электронная микрофотография подслизистогокрая в контрольной ткани. Иллюминация с максимальной интенсивностью в течении10 минут без преинкубации в МС не имеет эффектов на ультраструктуру ИКК (митохондрии не конденсированы), тонкиенерегулярные ветвистые гладкомышечные клетки (ВГМК), нервы (Н) и собственноциркулярные мышцы (ЦМ).
SUB: подслизистая
В и С: обратите внимание, ИКК послеинкубации в МС в течении 45 минут, без последующей иллюминации (В) или с 2минутной иллюминацией с максимумом интенсивности (С) претерпели изменение конформации митохондрий отконденсированной в ортодоксальную. В отличие от этого, ультраструктурасохранена, включая щелевые контакты (ЩК).
Изображение 6. Ткань инкубированная в МС в течении 7минут с последующей иллюминацией максимумом интенсивности в течении 2 (А) и 10минут (В).
А: после 2 минутной иллюминации единственныеультраструктурные изменения — этопоявление митохондрий с ортодоксальной конформацией ( сравните с изображением5С: 45 мин в МС, 2 мин в свете). IC – интерстициальные клеткиКэйджела, bSM — тонкие нерегулярные гладкомышечные клетки, CM — собственноциркулярные мышцы, N – нерв подмышечногосплетения.
В: после 10 минутной иллюминации, ИККсерьёзно повреждены – дизинтеграция цитоплазматических органелл и разрывыплазматической мембраны. Базальнаяпластинка ещё интактна. Отростки ВГМ и ЦМ клеток повреждены значительно меньше.
Изображение 7.
А:Слабосильная электронная микрофотография ткани освещённой в течении 10 минут с максимумом интенсивностипосле 7 минутной преинкубации в МС. Нетникакого указания на структурыеповреждения собственно ЦМ, внутримышечных капилляров (К) и фибробластов(Ф), в то время как слой клеток,граничащих с субмукозой (СУБ) значительно поражён.
В: при высоком увеличении ( те же условия) большие повреждения ограничены ИКК богатыми митохондриями, в то времякак тонкие нерегулярные ВГМК, ЦМ и нервыне повреждены. Сохранены щелевые контакты между глубоко лежащими ЦМклетками и между ИКК.