Реферат: Математическое моделирование биосинтеза продуктов метаболизма

Московский Государственный Университет Инженерной Экологии

Кафедра «Экологическая и промышленная биотехнология»

«Математическоемоделирование биосинтеза продуктов метаболизма»

Реферат на сдачу экзамена по кандидатскому минимуму по специальности:

 03.00.23 – Биотехнология.

Аспирант: Осипов Д.С.

Зав. каф.: д.т.н., проф. Бирюков В.В.

Москва – 2002

Введение.

МЕТАБОЛИЗМ – греческое слово metabole, означающее перемена, превращение.

В физиологическом смысле метаболизм – этопромежуточный обмен, т. е. превращение определенных веществ внутри клеток смомента их поступления до образования конечных продуктов (напр., метаболизмбелков, метаболизм глюкозы, метаболизм лекарственных препаратов).

С точки зрения промышленной биотехнологии метаболизм– это образование в процессе роста и развития клеток ценных биохимическихпродуктов – некоторые из них выделяются в среду (внеклеточные продукты),некоторые накапливаются в биомассе (внутриклеточные продукты). С помощьюметаболизма получают антибиотики, молочную  и лимонную кислоту, пищевые консерванты имногие другие продукты.

В естественных условиях метаболизм настроен так,чтобы производить минимальное количество необходимых метаболитов. Промышленноепроизводство, направленное на получение максимальной прибыли, такая ситуацияникак не устраивает. Поэтому, для максимизации прибыли необходимо произвестиоптимизацию следующих технологических параметров:

­–       выходапродукта в расчете на потребленный субстрат;

–                  

–                  

Оптимизация технологии биосинтеза метаболитовсостоит из следующих основных этапов [5]:

1)      Первоначальнаяселекция штамма микроорганизмов;

2)      Определениеоптимальных значений температуры, рН, тоничности и потребности в кислороде;

3)      Определениеоптимального режима питания и накопления биомассы;

4)      Изменениегенетической структуры организма для увеличения образования продукта.

Разработка 3-его этапа, непосредственно связана сбиосинтезом. Для нахождения режима питания и накопления биомассы, оптимальногодля биосинтеза метаболитов необходимо математическое описание процесса[1,2,3,4]. Кроме нахождения оптимальных условий проведения процесса,математическая модель используется для автоматизации биосинтеза, что всовременной биотехнологической промышленности не менее важно.

Прежде чем приступить, к описанию моделей приведем принятыеобозначения основных количественных характеристик процесса биосинтеза.

Кинетические характеристики процесса биосинтеза.

Обычно состояние процесса определяется следующими основнымипараметрами:

–       концентрациябиомассы микроорганизмов – Х, г/л;

–       концентрацияпитательной среды – субстрата (или его основного компонента) – S, г/л.

–                  P, г/л.

Кинетические характеристики процесса отражают скоростьпротекания биохимических превращений. Эти превращения, естественно, отражаютсяна всех указанных выше параметрах процесса – биомассе, продукте и субстрате.

Важным показателем процесса является скорость роста биомассы. Для описанияскорости роста используется такая характеристика, как общая скорость роста – QX:

<img src="/cache/referats/12537/image002.gif" v:shapes="_x0000_i1025">                                                         (1).

Больший интерес для характеристики интенсивности ростапредставляет не величина QX,а удельная скорость роста впересчете на единицу биомассы (ведь рост биомассы пропорционален концентрацииклеток). Она обозначается буквой m:

<img src="/cache/referats/12537/image004.gif" v:shapes="_x0000_i1026">                                                         (2).  

Размерность величины m – [1/ч].

Рассмотрим теперь второй параметр процесса ферментации –концентрацию субстрата S. По аналогии с ростом биомассы, можно ввестикинетическую характеристику – скоростьпотребления субстрата QS:

<img src="/cache/referats/12537/image006.gif" v:shapes="_x0000_i1027">                                                   (3).

Знак ‘–‘ обозначает, что скорость потребления положительна,когда концентрация субстрата в среде падает (т.е. скорость  изменения концентрации отрицательна).

Аналогично, удельнаяскорость потребления субстрата, которую обозначим малой буквой qS, равна:

<img src="/cache/referats/12537/image008.gif" v:shapes="_x0000_i1028">                                        (4).

При биосинтезе метаболитов, наряду с ростом биомассы,происходит накопление в среде продукта метаболизма (его текущая концентрация – Р).

Общая скорость биосинтезапродукта метаболизма QР в периодическом процессе равна:

<img src="/cache/referats/12537/image010.gif" v:shapes="_x0000_i1029">                                                          (5).

Удельная скоростьбиосинтеза продукта единицей биомассы обозначается qР и равна:

<img src="/cache/referats/12537/image012.gif" v:shapes="_x0000_i1030">                                                        (6).

Для математического описания биосинтеза продуктовметаболизма различными исследователями было предложено много различных моделей.Все эти модели можно разделить на следующие группы:

1) Математические модели кинетики биосинтеза продуктовметаболизма как функция от удельной скорости роста;

2)      Субстрат-зависимыемодели кинетики биосинтеза продуктов метаболизма;

3)      Модели,основанные на концепции возраста культуры микроорганизмов .

Во время биосинтеза происходит также процесс уменьшенияколичества метаболитов, для описания этого феномена были предложены моделидеградации (инактивации) продуктов метаболизма.

Математические модели кинетики биосинтеза продуктов метаболизма как функцииот удельной скорости роста.

Математический параметр – удельная скорость роста m– послужил основой составления многих математических моделей биосинтезапродуктов метаболизма. Процессы биосинтеза продуктов издавна делят на двабольших класса – связанные с ростом и не связанные с ростом. В качестве примера первого класса можноназвать биосинтез конститутивных ферментов клетки, а второго класса — биосинтезмногих антибиотиков, интенсивный синтез которых происходит после прекращенияроста микроорганизмов.

Удельная скорость биосинтеза связанных с ростом продуктовможет быть выражена простым соотношением [5]:

<img src="/cache/referats/12537/image014.gif" v:shapes="_x0000_i1031">                                                    (7),

где    YP/X – выход единицыпродукта с единицы биомассы: (dP/dX).

Более сложное выражение было предложено Людекингом и Пайри[6]:

<img src="/cache/referats/12537/image016.gif" v:shapes="_x0000_i1032">                                          (8),

где    qP0– эмпирическая константа.

В этом случае биосинтез продукта, с одной стороны,ассоциирован с ростом, а, с другой, осуществляется покоящейся клеткой [7].Модель (8) впервые была предложена для описания синтеза молочной кислоты.

Есть ряд уравнений, учитывающих нелинейный характер связи qP и удельнойскорости роста:

<img src="/cache/referats/12537/image018.gif" v:shapes="_x0000_i1033">                                                      (9),

<img src="/cache/referats/12537/image020.gif" v:shapes="_x0000_i1034">                                                       (10),

где    а и в– эмпирические константы.  

<img src="/cache/referats/12537/image022.jpg" v:shapes="_x0000_s1027">
Рис. 1. Форма зависимости qР(m) для уравнений (9) и(10).

На рис. 1 показаны графики функций (9) и (10), эти уравнениядают выпуклую (9) и вогнутую (10) кривые, выходящие из нуля, но эти функциимогут иметь также дополнительный свободный член qP0:

<img src="/cache/referats/12537/image024.gif" v:shapes="_x0000_i1035">                                             (11),

<img src="/cache/referats/12537/image026.gif" v:shapes="_x0000_i1036">                                             (12).

<img src="/cache/referats/12537/image028.jpg" v:shapes="_x0000_s1029">
Тогда графики функций (11) и (12) в отличии от (9) и (10) выходят не из нуля, аиз некоторой точки qP0на оси y,  что продемонстрировано на рис. 2.

Рис. 2. Форма зависимости qР(m) дляуравнений (11) и (12).

Возможны также эмпирические уравнения типа [8,9]:

<img src="/cache/referats/12537/image030.jpg" v:shapes="_x0000_s1031">
<img src="/cache/referats/12537/image032.gif" v:shapes="_x0000_i1037">                                                 (13),                                                                                                                 <img src="/cache/referats/12537/image034.gif" v:shapes="_x0000_i1038">                                          (14).

где а, b, с – эмпирические константы.

Рис. 2. Форма зависимости qР(m) дляуравнений (13) и (14).

По аналогии с уравнениями (11) и (12) уравнение (14)начинается, не из 0 по оси ординат, а из некоторой точки a, что означает начало синтезапродукта без роста биомассы.

Субстрат-зависимые модели кинетики биосинтеза продуктов метаболизма.

С точки зрения математики, уравнения, в которых в качествеаргумента выступает m, предполагают, что совсем неважно, каким образомформируется то или иное значение m. Например, величину mможно изменять путем уменьшения концентрации углеродного субстратаили азотного субстрата, или путем снижения температуры или повышения величины рН.Для процессов, связанных только с ростом, возможно скорость биосинтеза при этомбудет одинакова. Для несвязанных с ростом процессов небезразлично, каким путеммы будем изменять величину m.  Лимитированиеуглеродом, лимитирование азотом, повышение рН или снижение температуры,давая одно и то же значение скорости роста, могут давать совершенно различныескорости биосинтеза продукта метаболизма. Другими словами, связь между qP и mне имеет строго причинно-следственного характера, а обусловлена влиянием на обеэти кинетические характеристики одних и тех же факторов внешней среды. Длятаких процессов необходимо использовать уравнения, которые в качествеаргументов содержат независимо влияющие первичные факторы: концентрация тогоили иного субстрата, температура или величина рН.

Биосинтез продукта может описываться однофакторными илимногофакторными уравнениями. Кроме того, было установлено, что структурызависимостей qPот S, P, температуры и величины рН аналогичны структурамтаких же уравнений для роста биомассы, например: Моно, Андрюса, Перта,  Хиншельвуда и т.д. Например, если субстратвлияет на qPпо Андрюсу, то имеем [10]:

<img src="/cache/referats/12537/image036.gif" v:shapes="_x0000_i1039">                                               (15),

где    qm –максимальная удельная скорость биосинтезапродукта;

        K’S – константа насыщения;

        Ki – константа ингибирования продуктом.

Многофакторные зависимости здесь чаще бывают мультипликативными, чем аддитивными. Приведем зависимостьмультипликативного [11] и аддитивного влияния концентрации субстрата помеханизму Моно:

<img src="/cache/referats/12537/image038.gif" v:shapes="_x0000_i1040">                        (16),

<img src="/cache/referats/12537/image040.gif" v:shapes="_x0000_i1041">                    (17).

Применяются также уравнения с не разделяющимися эффектамифакторов, например, типа Контуа [10] или неконкурентного торможения продуктом[5]:

<img src="/cache/referats/12537/image042.gif" v:shapes="_x0000_i1042">                                      (18),

<img src="/cache/referats/12537/image044.gif" v:shapes="_x0000_i1043">                           (19).

К сожалению, невозможно изложить все кинетическиезависимости биосинтеза продуктов от первичных факторов в столь короткой работе.Данный материал подробно изложен в монографии [14], в которой приведены нетолько несколько десятков уравнений, но и произведен их анализ.

Модели, основанные на концепции возраста культуры микроорганизмов.

Для биосинтеза продуктов метаболизма часто бываетнедостаточно только благоприятных “внешних” факторов среды. Потому что вбиосинтезе участвуют внутриклеточные ферменты микроорганизмов, промежуточныепродукты, содержание которых в клетке зависит от предыстории развития культуры.Слишком быстро выросшая культура часто неэффективна с точки зрения биосинтезапродукта. У микробиологов есть выражение “культура ушла в ботву”, что означаетбиомассы – много, продукта – мало или вообще нет. Однако, учитывать этивнутриклеточные компоненты при моделировании очень проблемно – их трудноизмерять и соответственно находить кинетические коэффициенты.

Вместо этого предложены некоторые феноменологические подходык оценке физиологического состояния микробной биомассы, основанные на оценке возрастного состояния популяции клеток.

Есть несколько подходов для учета возраста культуры.Один из них заключается в определении распределения клеток микроорганизмов повозрастам [12]. Тогда значение удельной скорости биосинтеза продукта можносчитать как бы суммой скоростей, даваемых разными возрастными фракциямибиомассы:

<img src="/cache/referats/12537/image046.gif" v:shapes="_x0000_i1044">             (20),

где    ΔXi – концентрациябиомассы i-ойвозрастной группы;

         qi – удельнаяскорость биосинтеза биомассой i-ой возрастной группы.

При этом, вполне возможно, что значения q1,q2,… ,qn  не будутодинаковыми: “молодежь” не синтезирует нужный продукт, слишком старые клетки –тоже.

Японским ученым Аибой был предложен более простой подход,использовать для оценки возраста культуры так называемый средний возрастпопуляции <img src="/cache/referats/12537/image048.gif" v:shapes="_x0000_i1045"> как параметр,определяющий биосинтетическую активность культуры [13]. Биологически терминвполне понятен – это сумма возрастов всех клеток, деленная на их количество:

<img src="/cache/referats/12537/image050.gif" v:shapes="_x0000_i1046">                                                 (21),

где    λi – возраст i-ой возрастной группы.

Если последовательно уменьшать поддиапазоны Δt и ΔΧ,доведя их до бесконечно малых dX и dt,то для среднего возраста можно получить интегральную формулу:

<img src="/cache/referats/12537/image052.gif" v:shapes="_x0000_i1047">                                     (22),

где    Х0– начальная концентрация биомассы;

         <img src="/cache/referats/12537/image054.gif" v:shapes="_x0000_i1048"> – средний возрасткультуры в начальный момент культивирования.

Другим способом упрощения возрастной зависимости являетсяразделение возрастного диапазона клеток на 2 класса – продуктивный (вышенекоторого значения) и не продуктивный [14]:

<img src="/cache/referats/12537/image056.gif" v:shapes="_x0000_i1049">                                         (24),

где    λ*– возраст зрелости;

        qP* – удельнаяскорость биосинтеза клетки, по достижении ею возраста зрелости.

Теперь остается рассмотреть форму зависимости удельнойскорости биосинтеза продукта qР от среднего возрастакультуры: <img src="/cache/referats/12537/image058.gif" v:shapes="_x0000_i1050">

Если зависимость имеет возрастающий характер с насыщением,то зависимость удобно выразить в форме, похожей на уравнение Моно:

<img src="/cache/referats/12537/image060.gif" v:shapes="_x0000_i1051">                                                   (25).

Если, наоборот, она падает с возрастом, то лучше подходитвыражение, подобное уравнению Иерусалимского:

<img src="/cache/referats/12537/image062.gif" v:shapes="_x0000_i1052">                                                (26).

Если зависимость имеет экстремум, то оно может бытьвыражена, например, с помощью аппроксимирующего полиномиального уравнения [15]:

<img src="/cache/referats/12537/image064.gif" v:shapes="_x0000_i1053">                                          (27).

Однозначная зависимость между qР и <img src="/cache/referats/12537/image048.gif" v:shapes="_x0000_i1054"> на практикевстречается редко, часто зависимость скорости биосинтеза продукта от возрастаучитывают в виде мультипликативного сомножителя, сопряженного с основной частьюуравнения, учитывающего влияния остальных факторов.

Модели деградации (инактивации) продуктов метаболизма.

Не всегда синтезированные продукты метаболизма остаютсяустойчивыми; часто они настолько нестабильны, что разрушаются уже в процессесамой ферментации. Поэтому, описывая материальный баланс по продуктуметаболизма, необходимо учитывать кинетику его инактивации:

<img src="/cache/referats/12537/image066.gif" v:shapes="_x0000_i1055">                                              (28),

где    <img src="/cache/referats/12537/image068.gif" v:shapes="_x0000_i1056"> – скорость деградациипродукта метаболизма.

При рассмотрении синтеза метаболитов, использоваласьудельная скорость, в случае деградации, вводить удельную скорость не корректно,т.к. продукт существует отдельно от биомассы, и его деградация не зависит вобщем случае от ее концентрации.

Рассмотрим модели кинетики деградации:

<img src="/cache/referats/12537/image070.gif" v:shapes="_x0000_i1057">                                                              (29),

деградация отсутствует.

<img src="/cache/referats/12537/image072.gif" v:shapes="_x0000_i1058">                                                             (30),

деградация идет с постоянной скоростью. Такое выражениестранно выглядит в начале процесса, когда продукта еще нет; из уравнения жеполучается, что концентрация продукта снижается ниже нуля, что не имеетфизического смысла.

<img src="/cache/referats/12537/image074.gif" v:shapes="_x0000_i1059">                                                          (31),

реакция разложения первого порядка, пропорциональноколичеству образовавшегося продукта [16].

<img src="/cache/referats/12537/image076.gif" v:shapes="_x0000_i1060">                                                                  (32),

реакция разложения n-ого порядка, при чем n может быть как больше 1, так и меньше и не быть целымчислом.

<img src="/cache/referats/12537/image078.gif" v:shapes="_x0000_i1061">                                                      (33),

реакция разложения зависит не только от концентрациипродукта, но и от концентрации биомассы.

<img src="/cache/referats/12537/image080.gif" v:shapes="_x0000_i1062">                                                  (34),

скорость реакции разложения зависит от концентрации  биомассы и возрастает с концентрациейпродукта до какого-то предела.

Приведенные уравнения инактивации (29)-(34) наиболеераспространенные, существуют также и другие более сложные зависимости.

Модель накопления продукта метаболизма на примере лейцина.

L-лейцин-незаменимая аминокислота, необходимая для промышленного получения лизина.Производство лизина базируется на лейцинозависимых штаммах. Годовоепроизводство лизина составляет приблизительно 500000 т/г. Лизин широкоиспользуется в с/х в качестве кормовой добавки. Лейцин также применяется вспортивном питании, т.к. является предшественником незаменимых жирных кислот,входящих в состав клеточных мембран.

Элементная формула L-лейцина (L-a-аминоизокапроноваякислота): C5H10NH2COOH.

Основным способом производства L-лейцина является микробиологическийсинтез с использованием штамма Corynebacterium glutamicum. Биосинтез проводился влабораторном биореакторе. В отбираемых пробах определялась  оптическая плотность – Х, содержаниелейцина – P исодержание редуцирующих веществ (РВ) по Бертрану – S.

<img src="/cache/referats/12537/image082.gif" v:shapes="_x0000_s1033">
Полученные результаты приводятся в таблице 1.

Таблица 1.

Простейшимпредположением о механизме микробиологического биосинтетического процессаявляется обобщение данных о том, что биосинтез, с одной стороны, ассоциирован сростом, а с другой, осуществляется покоящейся клеткой.

Поэтому было решеноиспользовать следующее соотношение (8):

                   <img src="/cache/referats/12537/image084.gif" v:shapes="_x0000_i1063">                                   (35),

где    P – концентрацияпродукта (лейцина), г/л;

         aP, bP – эмпирические константы.

aP, bP были определены методом наименьших квадратов: aP=13.27, bP=1.249,сумма квадратов отклонений  QP составила 0,884, а средняя квадратичная ошибка SP равна ± 0.6648.

<img src="/cache/referats/12537/image086.gif" v:shapes="_x0000_s1034">
На рис. 3 показаны экспериментальные значения концентрации лейцина и модельные,из рисунка видно, что модель (8) в данном случае достаточно хорошо описываетбиосинтез продуктов метаболизма.

Рис. 2. Графическая интерпретация модели биосинтеза лейцина(35).

Список литературы.

1. Арзамасцев А.А., Андреев А.АМатематические модели кинетики микробного синтеза: возможности использования иновые подходы к разработке // Вестн. Тамб. ун-та. Серия: Естеств. и техн.науки.– 2000.– т.V., №1– с. 111-130.

2. Renss M. Моделирование иоптимизация процессов // 8th Int.Biotechnol. Symp., Paris– 1988.– vol. 1.– p.523-536.

3. Zeng An-Ping Кинетическая модель полученияпродуктов микробных клеток и клеток млекопитающих // Biotechnol. and Bioeng.– 1994.– vol. 45., N 4.– p. 314-324.

4. Vanrolleghem P.A. Структурный подход для выбора средикандидатов в модель схемы метаболизма и установление неизвестныхстехиометрических коэффициентов // Biotechnol. and Bioeng.–1998.– vol. 2., N 3.– p.133-138.

5. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов иклеток.– М.: Мир.– 1978.

6. Luedeking R., Piret E.L. A kinetic study ofthe lactic acid fermentation: Batch process at controlled pH // J. Biochem.Microbiol. Technol. Eng.– 1959.– vol. 1., N 4.– p. 393-412.

7. Осипов Д.С., Гусельникова Т.В.и др. Математическая модельбиосинтеза L-лейцина // Труды МГУИЭ.– 2001.– т.V.– с. 19-23.

8. Mori A., Terui G. Kinetic studies onsubmerged acetic acid fermentation: Inhibition by ethanol // J. Ferment.Technol.– 1972.­– vol. 50, N 11.– p. 776-786.

9. Музыченко Л.А., Валуев В.И.Использование полунепрерывного культивирования микроорганизмов для полученияпродуктов биосинтеза // В кн.: Теория и практика непрерывного культивированиямикроорганизмов.– Красноярск.– 1978.– с. 112-113.

10. Bajpai R.K., Reuss M. A mechanistic modelfor penicillin production // J. Chem. Technol. and Biotechnol.– 1980.– vol.30,– p. 332-344.

11. Баснакьян И.А., Бирюков В.В.,Крылов Ю.М. Математическое описание основных кинетических закономерностейпроцесса культивирования микроорганизмов // В кн.: Итоги науки и техники.Микробиология. Т. 5. Управляемое и непрерывное культивированиемикроорганизмов.– М. – 1976.– с. 5-75.

12. Shu P. Mathematical model for productaccumulation in microbiological processes // J. Biochem. Microbiol. Technol.Eng.– 1961.– vol. 3, N 1,– p. 95-109.

13. Aiba S., Hara M. Conception of averagecumulative age of microorganisms // J. Gen. and Appl. Microbiol.– 1965.– vol.11,– p. 25-41.

14. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодическихпроцессов микробиологического синтеза.– М.: Наука.– 1985.

15. Фишман В.М. Математическое описание и оптимальноеуправление процессом биосинтеза антибиотиков // Дис. канд. техн. наук.– М.:Московский институт химического машиностроения– 1970.

16. EttlerP., Votruba J. Determination of the optimal feeding regime during biosynthesisof erythromycin // Folia microbiol.– 1980.– vol. 25,– p. 424-429.

 

еще рефераты
Еще работы по биологии