Реферат: Определение активности ферментов

Российскийхимико-технологический Университет

им.Д.И.Менделеева

Кафедрапромышленной биотехнологии

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАБОТА

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Выполнила: студентка

группыЭ-35

ТимошкинаЕ.А.

Преподаватель:

МартимьяноваН.А.

Москва,1996 г

СОДЕРЖАНИЕ

TOC «Заголовок 1;2; Заголовок2;3; Заголовок 3;4; глава;1»

GOTOBUTTON _Toc357222619 PAGEREF _Toc357222619 1

Получение ферментных препаратов. GOTOBUTTON _Toc357222620 PAGEREF _Toc357222620 4

Общие методы определения активности ферментов. GOTOBUTTON _Toc357222621 PAGEREF _Toc357222621 6

Методы определения активности протеолитических ферментов GOTOBUTTON _Toc357222622 PAGEREF _Toc357222622 11

Литература GOTOBUTTON _Toc357222623 PAGEREF _Toc357222623 19

Свойства ферментов как биологическихкатализаторов.

Фермент — отлат. fermentum — закваска; знзим — отгреч. эн — внутри, зиме — закваска.

Ферменты, или энзимы, — это катализаторы белковой природы,образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Происхождение терминовсвязано с тем, что первоначально ферментативные процессы были открыты и изученыв бродильном производстве. В каждой клетке имеются сотни различных ферментов. Сих помощью осуществляются многие химические реакции, которые могут с большой скоростьюидти при температурах, подходящих для данного организма, т.е. в пределах от 5до 400 С. Чтобы эти реакции с той же скоростью протекали внеорганизма, потребовались бы высокие температуры и резкие изменения некоторыхдругих условий. Для клетки это означало бы гибель, так как вся работа клеткистроится таким образом, чтобы избежать любых сколько-нибудь заметных измененийв нормальных условиях ее существования. Следовательно, ферменты можноопределить как биологические катализаторы,т.е. как вещества, ускоряющие реакции. Они абсолютно необходимы, потому что безних реакции в клетках протекали бы слишком медленно и не могли поддерживатьжизнь. Совокупность биохимических реакций, катализируемых ферментами,составляет сущность обмена веществ, являющегося отличительной чертой всех живыхорганизмов. Через ферментативный аппарат, регуляцию его активности происходит ирегуляция скорости метаболических реакций, их направленности.

Являясь катализаторами, ферменты имеют ряд общих с небиологическимикатализаторами свойств:

1. Ферменты не входят всостав конечных продуктов реакции и выходят из нее, как правило, в первоначальномвиде, т.е. они не расходуются в процессе катализа (в настоящее время доказано,что некоторые ферменты в конце химической реакции подвергаются модификации идаже распаду, а не освобождаются в неизменном виде, как постулировалЛ.Михаэлис).

2. Ферменты не могутвозбудить те реакции, протекание которых противоречит законам термодинамики,они ускоряют только те реакции, которые могут протекать и без них.

3. Ферменты не смещаютположения равновесия, а лишь ускоряют его достижение.

Специфические свойства:

1. Конечно же, по своемухимическому строению все ферменты являются белками.

2. Эффективностьферментов намного выше, чем небиологических катализаторов (скорость протеканияреакции при участии фермента выше на несколько порядков).

3. Ферменты обладают узкойспецифичностью, избирательностью действия на субстраты, т.е. на вещества,превращение которых они катализируют. Высокая специфичность ферментовобусловлена конформационной и электростатической комплементарностью между молекуламисубстрата и фермента и уникальной структурой активного центра фермента,обеспечивающими “узнавание”, высокое сродство и избирательность протеканияодной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций, осуществляющихсяодновременно в живых клетках.

Взависимости от механизма действия различают ферменты с относительной (или групповой)специфичностью и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторыхгидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи вмолекуле субстрата. Например, пепсин расщепляет белки животного и растительногопроисхождения, хотя они могут существенно отличаться друг от друга как похимическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическимсвойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы или жиры. Объясняется это тем,что местом действия пепсина является пептидная -СО-NH- связь. Для действия липазы, катализирующей гидролиз жиров наглицерин и жирные кислоты, таким местом является сложноэфирная связь.Аналогичной относительной специфичностью обладают также некоторыевнутриклеточные ферменты, например гексокиназа, катализирующая в присутствииАТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеютсяспецифические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фосфорилирование.

Абсолютнойспецифичностью действия называют способность фермента катализироватьпревращение только единственного субстрата. Любые модификации в структуресубстрата делают его недоступными для действия фермента.

Стереохимическаяспецифичность ферментов обусловлена существованием оптически изомерных L- иD-форм или геометрических (цис- и транс- ) изомеров химических веществ. “Так,известны оксидазы L- и D-аминокислот, хотя в природных белках обнаружены толькоL-аминокислоты. Каждый из видов оксидаз действует только на свой специфическийстереоизомер.

+ЅО2

L-аминокислота<img src="/cache/referats/5095/image002.jpg" v:shapes="_x0000_i1025">

a-кетокислота + NH3 + H2O

оксидаза L-аминокислот

+Ѕ

О2

D-аминокислота<img src="/cache/referats/5095/image002.jpg" v:shapes="_x0000_i1026">

a-кетокислота + NH3 + H2O

оксидаза D-аминокислот

Наглядным примеромстереохимической специфичности является бактериальная аспартатдекарбоксилаза,катализирующая отщепление СО2 только от L-аспаргиновой кислоты спревращение ее в L-аланин” [1].

4. Регулируемостьферментов как биокатализаторов. “Через регуляцию ферментативного аппарата осуществляетсяскоординированность всех метаболических процессов во времени и пространстве,направленное на воспроизведение живой метерии, поддержание постоянствавнутриклеточной среды, на приспособление к меняющимся внешним условиям”[2].

5. Термолабильностьферментов. Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтомукатализируемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры.Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышениитемпературы будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующимснижением скорости реакции. Таким образом, термолабильность, иличувствительность к повышению температуры является одним из характерных свойствферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. При 1000Спочти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляют, очевидно,только один фермент мышечной ткани — миокиназа, которая выдерживает нагреваниедо 1000С). При низких температурах (00С и ниже) ферменты,как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Во всехслучаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. Внастоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказаносуществование прямой зависимости между скоростью инактивации фермента истепенью денатурации белка. На термолабильность ферментов определенное влияниеоказывают концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.

6. Зависимость активностиферментов от рН среды. Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоныконцентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основномвыработанным в процессе эволюции физиологическим значением рН среды 6.0 — 8.0.рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений.Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2.0. Объясняется этотем, что пепсин входит в состав желудочного сока, содержащего свободную солянуюкислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента.С другой стороны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильно щелочной зоне (около10.0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназафункционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды. Влияниеизменений рН среды на молекулы фермента заключается в воздействии на состояниеи степень ионизации кислотных и основных групп (СООН-группы дикарбоновыхаминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина и др.). Приразных значениях рН среды активный центр может находиться в частичноионизированной или в неионизированной форме, что сказывается на третичнойструктуре белка и соответственно формировании активного фермент-субстратногокомплекса. Кроме того, имеет значение и состояние ионизации субстратов икофакторов.

Получение ферментных препаратов.

Для получения ферментных препаратовиспользуют как микроскопические грибы, так и бактерии и дрожжи. Иногдаполучение технического ферментного препарата кончается проведением процесса ферментации,например, в спиртовой промышленности для осахаривания крахмала используютжидкую культуру Aspergillus niger. Впоследствии ее добавляют в жидком виде в количестве10-12% к осахареваемому затору. Однако активность ферментов в культуральнойжидкости быстро снижается. Поэтому широко практикуют получение сухих техническихферментных препаратов.

Техническиепрепараты ферментов. Комплексный амилолитический ферментный препаратполучают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде споследующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препаратфермента получают путем экстракции такого “грибного солода” с последующимвыпариванием и сушкой. Еще более активные ферментные препараты можно выделитьиз культуральной жидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшимвысушиванием коагулятом при температуре 27-270С. Для осажденияфермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральнуюжидкость выпаривают при температуре 400 С до 40%-ного содержания сухихвеществ. Коагулят сушат вместе с наполнителем.

Комплексферментов протеолитического и амилолитического действия получают при помощикультуры Bacillus subtilis. Это аэробные, грамположительные, подвижные палочки.Для этих бактерий характерен очень богатый комплекс гидролитических ферментов.В качестве источников питания они могут использовать белки, углеводы, спирты,органические кислоты. Bacillus subtilis культивируют как методом поверхностногокультивирования на отрубях, так и в жидких средах особого состава по методуглубинного культивирования.

Целлюлолитическиеферментные препараты. Производство целлюлаз основывается на использованиикультуры гриба Trichoderma viride. Существующие в настоящее время способыполучения целлюлаз в глубинной культуре предполагает выращивание микроорганизмов-продуцентовцеллюлаз на питательной среде, содержащей в качестве источников углерода, какправило, очищенную целлюлозу, или же содержащие ее природные субстраты. Но получение целлюлазы с использованием вкачестве основного компонента среды природной целлюлозы (например, древесныеопилки) сопряжено с рядом технологических трудностей. Более рациональноиспользование питательной среды, содержащей растворимый “индуктор”. Такойпитательной средой может быть молочная сыворотка, основным компонентом которойявляется лактоза (предварительно от молочной сыворотки отделяют белок). Вкачестве продуцента может быть использован гриб Trichoderma lignorum, позволяющийполучить весь комплекс целлюлолитическихферментов, необходимый для расщепления природных целлюлозусодержащих субстратов.

Общиеметоды определения активностиферментов.

Прежде чем преступить к выделениюфермента, необходимо избрать и тщательно отработать метод определенияактивности, под контролем которого производится выбор наиболее эффективных приемовочистки ферментов, а затем и выполнение последовательных стадий егопрепаративного получения. Активность фермента меняется при различных условияхреакции и зависит от температуры, рН среды, от концентраций субстратов икофакторов. Учитывая это, при определении активности фермента на разных стадияхочистки необходимо строго соблюдать одни и те же условия. Желательно не ограничиватьсяопределением активности по одному какому-либо методу. Количество субстрата,превращаемого в условиях теста по определению активности фермента, должно бытьпропорционально количеству последнего и времени инкубирования. Если же неттакой пропорциональности, то активность рассчитывают по предварительно построенномукалибровочному графику, отражающему зависимость скорости реакции от количестваединиц фермента. Когда ход реакции нелинеен во времени, следует определятьначальную скорость реакции (по тангенсу угла наклона касательной к начальномуотрезку кривой превращения). Для этого легче всего применять такие методы измененияактивности, которые позволяют непрерывно следить за ходом превращения вовремени: спектрофотометрические методы, потенциометрические, полярографическиеи т.п. Для измерения скорости ферментативной реакции необходимо выбрать буфер,который не тормозит исследуемую активность и обеспечивает поддержание рН раствора,близкой к оптимальной для данного фермента. Реакцию проводят при температуре,лежащей в большинстве случаев в пределах 25-400С. При исследованииферментов, требующих присутствия кофакторов (ионов металлов, коферментов идр.), концентрация которых может снижаться по мере очистки фермента, вреакционную смесь следует добавлять недостающие кофакторы, например солиметаллов, АТФ, НАДФ и т.п. Также для определения активности ферментов вводятстабилизаторы в состав опытных смесей. Во многих случаях добавление желатина,альбумина и других добавок предотвращает денатурацию ферментного белка.

Спектрофотометрическиеметоды. Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенныхучастках спектра многими соединениями, являющимися активными группамиферментов, субстратами или продуктами реакции. Положение максимума поглощенияпри определенной длине волны определяется наличием в исследуемом материалеопределенных групп — аналитических форм. Для измерения спектров используютспециальные приборы — спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры и др.Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малымрасходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции вовремени. Для этого реакционную смесь помещают в кювету, вставленную втермостатируемый кюветодержатель. Через малый промежуток времени последобавления фермента (или субстрата) и быстрого перемешивания измеряют поглощениепри длине волны, характерной для используемого субстрата или конечногопродукта, образующегося в данной реакции. С помощью спектрофотометрического методаможно измерять непосредственно концентрацию некоторых ферментов (последостаточной очистки) по величине характерных максимумов поглощения прочносвязанных коферментов (простетических групп). Необходимо иметь произвольновыбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразитьчистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицызависит от избираемого метода определения. В случае спектрофотометрическогометода такой единицей может служить количество фермента, которое вызываетопределенное изменение в оптической плотности за определенное время при данныхусловиях опыта; если определяется продукт реакции, то единицей будет количествофермента, которое вызывает образование определенного количества вещества вминуту, и т.д. Тогда удельную активность фермента, которая является мерилом чистотыферментного препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка).

Дляцелей определения ферментов могут быть использованы не только измерениепоглощения света, но также измерения флюоресценции — спектрофлюорометрическиеметоды. Такое определение активности фермента в ряде случаев почувствительности превосходит спектрофотометрические методы на целый порядоквеличины. Некоторые коферменты и субстраты обладают сильной флюоресценцией. НАДи НАДФ в восстановленном состоянии имеют сильную флюоресценцию и нефлюоресцируют в окисленном состоянии. Поэтому спектрофлюорометрию используютдля изучения кинетики и механизма действия никотинамидных и флавиновыхферментов.

Колориметрические(фотометрические) методы. В основе этих методов лежит измерение при помощивизуального или фотоэлектрического колориметра окрашенного продукта,образующегося при взаимодействии субстрата или продукта действия фермента соспецифическими реактивами, которые обычно добавляются в фиксированную опытнуюпробу, взятую после остановки ферментативной реакции. Эти методы весьма разнообразны.Разработаны количественные методы, основанные на биуретовой реакции, прикоторой состав белка, очевидно не должен сказываться на результатах определения,т.к. эта реакция на пептидные связи, а не на боковые группы в белке. МетодГорнелла и соавторов, основанный на измерении полосы поглощения в области550-650 нм, используется для определения значительных количеств (1-10 мг) белкав пробе. Предлагаются биуретовые микрометоды, основанные на поглощенииультрафиолетовых лучей медно-белковыми комплексами: они позволяют определять0.1 — 2.0 мг белка в пробе. Число небелковых веществ, которые могут влиять на определенияс помощью биуретовой реакции, невелико, но следует вносить поправки на те вещества,которые присутствуют в высоким концентрациях (соли аммония, сахароза). Наиболееценными являются те фотометрические методы, которые позволяют следить вовремени за ходом ферментативной реакции без ее прекращения по изменению окраскихромогенного субстрата или добавленного индикатора. Метод Фолина и Чиокальто,предложенный для определения количества белка, основан на хромогенной природенекоторых боковых групп аминокислот, а также на присутствии в белках пептидныхсвязей. Этот метод обладает высокой чувствительностью (на пробу достаточно 0.01- 0.1 мг белка), но многие небелковые вещества мешают определению.

Внастоящее время для определения количества белка широко пользуются измерениямиинтенсивности поглощения света при 280 нм, которое обусловлено присутствием вбелке ароматических аминокислот. Количество этих аминокислот в разных белкахразлично и, следовательно, интенсивность неодинакова. В кювете толщиной 1 см ураствора, содержащего 1 мг “усредненного” белка в 1 мл, оптическая плотностьравна 1 при длине волны 280 нм. Нуклеиновые кислоты поглощают при 280 нм, номожно сделать поправку на их присутствие, проводя измерения и при 260 нм и при280 нм. Очень важна быстрота измерения активности ферментов. То же относится ик измерению количества сухого остатка или количества белка. Тем самым предпочитаютбыстрый метод определения белка путем измерения величины поглощения при 280 нм.Выигранное время важнее, за счет того, что удельное поглощение выделяемогобелка иногда значительно отличается от средней величины поглощения смесибелков, присутствовавших в исходном материале.

Манометрическиеметоды. Эти методы используются при определении активности фермента в техслучаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится вгазообразном состоянии. К таким реакциям относится главным образом те, которыесвязаны с процессами окисления и декарбоксилирования, сопровождающимися поглощениемили выделением кислорода и углекислоты, а также реакции, в которых выделениеили связывание газа происходит в результате взаимодействия продуктовферментативного превращения с добавленным в систему реактивом. Наблюдение заходом реакции во времени проводится в специальных приборах — манометрическихаппаратах Варбурга.

Другиеметоды. Сюда относится обширный ряд методов, включающих поляриметрию, вискозиметрию,потенцио- и кондуктометрические измерения и т.п. Также определениеактивности можно выполнять, используяметоды хроматографии и электрофореза на бумаге. Эти методы высокочувствительныи специфичны, что делает их во многих случаях незаменимыми; они позволяютзначительно сократить расход фермента на измерение активности, но не всегдаприменимы ввиду продолжительности разделения веществ в процессе хроматографии(и электрофореза).

Специальные методы определенияактивности пепсина ипапаина.Пепсин и папаин относятся к одной изнаиболее многочисленных групп ферментов — протеолитические ферменты (протеазы).Они принадлежат к классу гидролаз, к подклассу пептидгидролаз и катализируютрасщепление белков и полипептидов в соответствии с уравнением :

R1CONHR2+ H2O ®R1COOH + H2NR2 ,

R1 и R2 — остатки аминокислот, ди-или полипептиды.

Т.е. протеазы катализируют расщеплениепептидной связи

¾CO¾NH¾ .

Теперьнемного подробнее о пептидгидролазах.

Подкласс пептидгидролаз делится наследующие группы:

1. аминопептидазы

(a-аминоацилпептидгидролазы) катализируют гидролиз полипептидовпо месту пептидной связи, находящейся рядом со свободной аминной группой.

действие

R1 фермента R2

| ¯ |

H2N ¾ C ¾ C ¾ NH ¾ C ¾ C ¾

| ║

H O H O

2. карбоксипептидазы(пептидиламинокислотные гидролазы) катализируют расщепление полипептидов поместу пептидной связи, находящейся рядом со свободной гидроксильной группой.

¯ |

¾CO¾NH¾C¾H

действие COOH

фермента

3. дипептидазы (дипептидгидролазы)катализируют гидролитическое расщепление на свободные аминокислоты.

NH2CH2CONH¾CH2¾COOH + H2O ®2CH2NH2COOH

глицил-глицин гликолол

Дипептидазы расщепляют только такиепептидные связи, по соседству с которыми находятся одновременно свободныекарбоксильная и аминная группы. Большое влияние на действие дипептидаз оказываетналичиеa-водородных атомов, находящихся у атомовуглерода, связанных со свободной карбоксильной и аминной группами. При заменеэтих атомов другими группировками активность ферментов снижается или совсемисчезает.

4. протеиназы — (пептидилгидролазы)гидролизуют непосредственно белок. При этом образуются полипептиды и свободныеаминокислоты. К этой подгруппе протеиназ принадлежит пепсин, трипсин, химотрипсин,папаин и др.

В процессе действия ферментов насубстраты решающую роль играет структура молекул субстрата (соответствующаячасть молекулы субстрата), в которой происходит разрыв. Характер распадабелковой молекулы на пептиды и аминокислоты зависит от природы субстрата ивнешних условий (рН, температуры и др.). В качестве белковых субстратовиспользуют желатин, гемоглобин, казеин, сывороточный альбумин.

Методы определения активностипротеолитических ферментов

Модификационныйметод. Модификационный метод с применением субстрата казеина основан наопределении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действиемисследуемых протеолитических ферментов, содержащихся в материале, взятом наанализ. Скорость реакции определяют по количеству образовавшихся аминокислот — тирозина (

a-амино-b-оксифенилпропионовая кислота) итриптофана (a-амино-b-индолилпропионовая кислота), которыеустанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Этим методомопределяют указанные аминокислоты как в свободном, так и в связанном состоянии.

Поколичеству тирозина и триптофана, содержащемуся в гидролизате, определяютколичество превращенного белка в процессе ферментативной реакции (из расчетасодержания в белке 6% тирозина и 1.8% триптофана). В основу расчета активностипротеолитических ферментов положена зависимость степени гидролиза белка отчисла единиц активности фермента, введенных в ферментативную реакцию. На основеэтой зависимости составляется график.

Посколькув данном методе количество аминокислот, характеризующих количествопревращаемого белка, определяется по интенсивности окраски реакционных сред — оптической плотности после реакции с реактивом, то в графике для простотырасчета вместо количества превращенного белка ставится пропорциональная емуоптическая п

еще рефераты

Еще работы по биологии

Реферат по биологии

Распространение животных на Земле

9 Июня 2015

Реферат по биологии

Роль микроэлементов в обменных процессах растений и на накоплении ими биологически активных веществ (Реферат (обзор литературы) () WinWord 97)

29 Августа 2013

Реферат по биологии

Факторы вызывающие мутацию (Доклад)