Реферат: Векторные системы для молекулярного клонирования в Bacillus subtilis

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологическийфакультет

кафедра генетики

ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО

КЛОНИРОВАНИЯ В Bacillussubtilis

Курсовая работастудента3 курса КОВАЛЬЧУКА К.В.

Научныйруководитель:

канд. биол.наук,

доцент ТИТОКМ. А.

Минск 2004г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………3 ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………..4

1.1 Клонирующие векторы…………………………………………………..4

1.2 Векторы экспрессии……………………………………………………...6

1.3. Векторы для клонирования промоторов………………………………10

1.4 Векторы с регулируемой копийностью………………………………..10

1.5 Векторы для направленной инактивации генов………………………10

1.6 Векторы для получения гибридных белков…………………………...10

1.7 Геномные векторы……………………………………………………....10

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………..10

ЛИТЕРАТУРА………………………………………………………………..10

ВВЕДЕНИЕ

Генетическаяинженерия является одним из важнейших направлений биотехнологии, науки обиспользовании живых организмов и биологических процессов в производстве. Посути, генетическая инженерия (её называют также молекулярным клонированием илитехнологией рекомбинантных ДНК) представляет собой совокупностьэкспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетическогоматериала из одного организма в другой. В основе этого переноса, лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) вдругую молекулу ДНК (вектор), которая способна реплицироваться всоответствующей клетке-хозяине.

Исторически сложилось так, что наиболее изученными в генетическом планеявляются грамотрицательные бактерии, в частности Escherichiacoli. И соответственнобольшинство векторных систем разработано именно для этого организма. Однакосуществует целый ряд бактерий обладающих свойствами, которые не присущи E. coli. Как правило, этограмположительные микроорганизмы, и чтобы изучать и использовать на практике ихсвойства разрабатываются векторные системы, учитывающие специфику данныхмикроорганизмов. Одним из таких микроорганизмов являются грамположительныебактерии Bacillussubtilis.

По изученности генетического аппарата клетки Bacillussubtilis находятся навтором месте после E .coli. Для них характереннечасто встречающийся среди бактерий процесс споруляции, и в этом плане они представляют значительныйтеоретический и практический интерес. B. subtilisимеют важное практическое значение: они широко используются в различных процессахферментации при промышленном получении антибиотиков и ферментов и в этомотношении обладают рядом ценных свойств, таких как способность секретироватьсинтезируемый белковый продукт в культуральную жидкость, способность расти надешёвых субстратах и обладать продуктивностью на один-два порядка выше, чем уграмотрицательных бактерий-продуцентов.

Поскольку B. subtilisобладаютцелым рядом описанных выше свойств, для этого организма было разработаномножество разнообразных векторных систем. В данной работе расмотрены основныетипы векторных систем, с помощью которых можно производить различныегенетические манипуляции в клетках B. subtilis.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первоначальнобольшая часть векторов для B. subtilisсоздавалась на основе геномовумеренных фагов (таких, как rho11 и phi105), т.к. они обладали большей стабильностью, чемвекторы на основе плазмид, реплицирующихся по типу катящегося кольца (rolling-circle-replication, RCR-плазмиды) (Негрук, 1991). Внастоящее время большинство векторов конструируется на основе репликоновтета-плазмид, обладающих высокой структурной и сегрегационной стабильностью.Кроме того, в последнее время разработан ряд так называемых геномных векторовпредоставляющих дополнительные возможности по сравнению с плазмидными векторами.

1.1. Клонирующиевекторы

В штаммах B. subtilisсодержится незначительное числоестественных плазмид, причём большинство из них являются криптическими. Однакоиз других видов рода Bacillus, а также других родовграмположительных бактерий, было выделено множество плазмид, способных кавтономной репликации в клетках B. subtilis. Первоначально плазмидные векторы для B. subtilisконструировались на основе мелких(размером меньше 10 kb) плазмид различных грамположительных бактерий, в первуюочередь на основе плазмид, выделенных из Staphylococcusaureus(pC194, pE194, pUB110 и др.). Однако векторныемолекулы, полученные на основе таких плазмид, проявляли высокую структурнуюнестабильность, и с их помощью можно было клонировать только короткие сегментыДНК, а длинные сегменты часто подвергались перестройкам (Michelet al., 1980; Ehrlichetal., 1986).

Нестабильностьмелких плазмид в клетках B. subtilisобусловлена механизмом ихрепликации. Указанные плазмиды реплицируются по типу катящегося кольца (RCRплазмиды), а вследствие разобщённостисинтеза лидирующей и отстающей цепей, в процессе репликации образуется одноцепочечнаяДНК, которая сильно стимулирует рекомбинацию между гомологичными последовательностями(Ehrlihetal, 1986). Одноцепочечный надрез,образуемый во время инициации репликации, также может быть причинойрекомбинации (Michel, Ehrlich, 1986; Baliesteretal., 1989; Grosetal., 1989). Кроме того, вставки ДНКмогут вызвать образование высокомолекулярных конкатемеров, увеличивая числокопий плазмиды (Gruss, Ehrlich, 1989; Dabertetal., 1992), что может повысить частотурекомбинации, а также поспособствовать отбору плазмид, утративших вставки.

Существует также другойтип плазмид, реплицирующихся в соответствии с механизмом тета-типа. Прирепликации по этому механизму не образуется интермедиатов в виде одноцепочечнойДНК, и по этой причине векторы, созданные на основе тета-репликонов гораздостабильнее и, следовательно, эффективнее векторов на основе RCRплазмид. Первые данные об этом былиполучены в экспериментах по получению и изучению свойств клонирующих векторов pHV1431, pHV1432, pHV1435 и pHV1436 (Janniereetal., 1990).

Челночный вектор pHV1436(рис. 1) был создан на основе репликона плазмиды pTB19. На основе репликона pAMb

1были сконструированы три клонирующих вектора: pHV1431, и полученные из него pHV1435 (путём инверсии rep-области pAMb1) и вектор pHV1432 (путём делеции небольшого фрагмента в последовательности rep-области pAMb1).

Рис. 1. Структура клонирующихвекторов. oripTB52и oripAMb

1, репликационные регионы природных плазмид pTB19 и pAMb1соответственно; pBR322,последовательность pBR322,включающая её репликационный регион; <img src="/cache/referats/22929/image004.gif" v:shapes="_x0000_i1026">

Данныевекторы оказались структурно намного более стабильными, чем векторы на основесигма-репликонов (Janniereetal., 1990):

(1) при их использованиинаблюдается гораздо более низкая частота рекомбинации между повторяющимисяпоследовательностями (снижена в 1000 раз)

(2) с их помощью можно клонировать значительно более длинные сегментыДНК; средний размер вставки 10 и 1 kb, с диапазоном 3 -17 kb и 0.1 — 1.7 kb для векторов на основе тетаи сигма репликонов соответственно

(3) в отличие от RCRплазмид они способны к стабильному поддержанию больших сегментов ДНК

Данные свойствахарактерны и для других векторов, являющихся производными тета-плазмид. Крометого, было показано, что в отличие от сигма-плазмид, тета-репликоны, совставками или без них, не образуют или образуют незначительное числовысокомолекулярных конкатемеров (Gruss, Ehrlich, 1988; Dabertetal., 1992a; Dabertetal., 1992b). Это также является одной из причиних структурной стабильности.

Помимо клонирующихвекторов для Bacillussubtilisбыл создан ряд векторов специальногоназначения: векторы экспрессии, клонирования промоторов и терминаторов, векторы с регулируемойкопийностью и т.д. При этом используются векторы на основе как сигма- так итета-репликонов.

1.2. Векторы экспрессии

В простейшем случае для экспрессии достаточно клонировать нужный генвместе с его промотором и сайтом связывания с рибосомой (ribosomebindingsite, RBS) в природную плазмиду, способнуюреплицироваться в хозяине, в котором нужно проэкспрессировать данный ген. Так,например, в B. subtilis былпроэкспрессировать ген термостабильной арабиназы термофильной бактерии Bacillusthermodenitrificans. Для этогофрагмент, содержащий данный ген (с предполагаемым промотором и RBS) был клонирован вприродную плазмиду pUB110(Takaoetal.,2002).

Иногда удобноэкспрессировать ген с не своего промотора, что позволяет вести экспрессию наболее высоком уровне, или контролировать её. Так, ген термоактивной пуллуланазыгипертермофильной анаэробной архебактерии Desulfurococcus mucosus(apuA) был успешно экспрессирован в B. subtilis(Duffneretal., 2000). Экспрессия генашла под контролем промотора PamyM(рис. 2).

Рис. 2. Структура вектора pJA803 для клонированияпуллуланазы. RepB — область репликации pUB110;Cm — ген устойчивости кхлорамфениколу; apuA — ген пуллуланазы; PamyM — промотор гена мальтогенной a

-амилазыиз B. stearothermophilus.

В обоих вышеописанных случаях наблюдался относительноневысокий уровень экспрессии, однако, белки секретировались в среду вколичестве, позволяющем их выделение в чистом виде и дальнейшее изучениесвойств.

В случае, когда необходимо регулировать уровень экспрессииили экспрессировать белок в очень больших количествах, используют более сложныесистемы экспрессии.

B. subtilis является оченьудобным организмом для проведения в нём экспрессии различных продуктов, т.к.эта бактерия обладает целым рядом полезных свойств: непатогенность, наличиемеханизмов секреции, хорошо изученные генетика и условия необходимые дляэкспрессии генов, простота манипуляций сиспользованием стандартных протоколов. Для повышения уровня продукциигетерологичных белков в клетках B. subtilisиспользуют штаммы, дефектные по протеазам. Кроме того, можно применить болееэффективные регуляторные элементы транскрипции и трансляции. Так, например, быласоздана кассета Veg(Lam etal.,1998) содержащая сильные регуляторные элементы, подходящие для эффективнойэкспрессии и секреции гетерологичного белка. В состав кассеты вошли: промотор B. subtilisvegI; lac оператор E. coli;сайт связывания с рибосомой (RBS) B. subtilis; лидернаяпоследовательность стафилококкового белка А (SPA); терминатор транскрипции глюконатового оперона B. subtilis (gnt); полилинкер (multiplecloningsite, MCS), содержащий сайты рестрикции XbaI, SmaI; стоп кодоны для всех рамоксчитывания; фланкирующие EcoRI и KpnI сайты (рис.3).

Рис. 3. Схематичное изображениерегуляторных элементов в кассете Veg.

Длина кассеты 356 п.н. RBS — сайт связывания рибосомы; SPA — стафилококковый белок А; MCS — полилинкер. Подробностив тексте.

Кассета Veg былавставлена в полилинкер челночного вектора pM2 (рис. 4) с образованием pM2Veg –вектора для экспрессии и секреции белка в B. subtilis.

Для проверки эффективности функционирования вектора pM2Veg, в качестве гена-репортёра применили ген эндоглюконазы (генcenA из Cellulomonasfimi).Была осуществлена вставка данного гена в сайт XbaI вектора pM2Veg. С помощью данной системы была достигнута продукцияэндоглюконазы на уровне более чем в четыре раза превышающем самый высокий изуровней продукции достигнутых с помощью других систем экспрессии. Экспрессия исекреция белка оставалась на стабильном уровне, и не оказывала ни какихнеблагоприятных эффектов на стабильность вектора и жизнеспособность клеток.

Рис. 4. Схематичное изображениевекторов pM2 и pM2Veg.

oripMB1и oripUB110- репликационные регионы плазмид pMB1 и pUB110,соответственно; <img src="/cache/referats/22929/image012.gif" v:shapes="_x0000_i1030"><img src="/cache/referats/22929/image014.gif" v:shapes="_x0000_i1031"><img src="/cache/referats/22929/image016.gif" v:shapes="_x0000_i1032"> - гены устойчивости к ампициллину, блеомицину инеомицину, соответственно.

С помощью pM2Veg в B. subtilis также экспрессирован ген hEGF – ген фактора ростаэпидермиса человека. Регистрируемый уровень hEGF был вполне сопоставим с уровнем экспрессии данного гена прииспользовании других систем. Эти данные указывают на то, что вектор pM2Veg может успешно использоваться дляэкспрессии в B. subtilisразнообразныхгетерологичных белков.

Ещё одна эффективная система экспрессии разработана на основе ксилозногооперона (Bhavsaretal.,2001).

Созданная система экспрессии состоит из следующих элементов (рис.5b):

1)

PxylA, под контролем которого идётэкспрессия клонированного гена;

2)

¢ — концевой участок гена xylA(генизомеразы ксилозы), содержащий оптимизированный CRE (catabolite-responsiveelement)- цис-действующий элемент, репрессирующий транскрипцию xyl оперона;

3)

xylO, с которымв отсутствие индуктора (ксилозы) связывается репрессор XylR;

4)

xylR, кодирующийрепрессор XylR, сосвоим промотором PxylR.

Система была вставлена в вектор pDG364 (Cutting,Horn, 1990), способныйинтегрировать с хромосомой B.subtilis всайте amyE путёмдвойного кроссинговера. Таким образом, полученный вектор, обозначенный как pSWEET, позволяетосуществлять встраивание ксилозной системы экспрессии в хромосому B. subtilis. Для определенияэффективности функционирования данной системы экспрессии к её проксимальномуконцу был пришит репортёрный ген bgaB – ген термостабильной b

-галактозидазы из B. stearothermophilus (полученнаяплазмида обозначена как pSWEET-bgaB) (рис.5b). bgaB можно вырезать вместе с RBS с помощью PacI и одной из рестриктаз для полилинкера, изаменить его любым интересующим геном.

<div v:shape="_x0000_s1027"> PacI

MCS

Рис. 5. a) Структура плазмиды pSWEET-bgaB. AmyE — сайты через которые идёт рекомбинация и интеграция схромосомой; Cm и Amp — гены резистентности кхлорамфениколу и ампициллину, соответственно; ori — область репликации в E.coli; PacI, сайт рестрикции; b) ксилозная система экспрессии крупнымпланом. Показаны: ген ксилозного репрессора xylR; промоторы генов xylR (PxylR) и xylA(PxylA) и оператор xylO; урезанный xylA(первые58 п.н. + TAA),включающий в себя оптимизированный CRE; сайт связывания рибосомы гена tagD (RBS); ген bgaB, кодирующий термостабильную b

-галактозидазу.

Данная система экспрессии(далее система xyl)была сравнена с широко применяемой системой экспрессии spac, основанной на применениилактозных репрессора и оператора E. coliдля контроля экспрессии в B.subtilis. Для этого былиспользован вектор pSPAC-bgaB, созданный путёмвставки bgaB вплазмиду pDR67(Weickert, Chambliss, 1990), содержащую spac систему дляинтеграции в сайт amyE.Для обеих систем экспрессии сайты связывания с рибосомой и окружающиегенетические элементы были одинаковые. Опыты показали, что
1) для системы xyl характерна значительно более высокая разница между уровнем синтезапродукта при индукции и при репрессии (экспрессия при индукции в 279 раз выше,чем при репрессии; для spacсистемы – в 16 раз); 2) уровень экспрессии при индукции в 16 раз выше, чем у spac системы; 3) вотсутствие индуктора уровень экспрессии ниже, чем у spac системы; 4) система xyl проявляет чувствительность кбольшему диапазону концентраций индуктора.

Была протестирована способностьсистемы xylобеспечивать ксилоз-зависимую комплементацию. Была проведена попыткакомплементировать термочувствительные мутанты (tag-12) по tagD гену, кодирующемуфермент, участвующий в синтезе тейхоевых кислот (глицерол-3-фосфатцитидилтрансфераза). Ген tagDдикого типа был клонирован в pSWEET(с образованием pSWEET-tagD) для экспрессии подконтролем системы экспрессии xyl.Мутанты с интегрированной в amyEс помощью pSWEET-tagD системой экспрессиии геном tagD подеё контролем были способны к росту при непермессивной температуре в присутствиииндуктора (ксилозы). Т.е. при росте при непермиссивной температуре происходила ксилоз-зависимая комплементацияданного температур зависимого мутанта tag-12.

Таким образом былопоказано, что pSWEETявляется эффективной системой для точно регулируемой экспрессии клонированныхгенов в B. subtilis и, в частностиновой эффективной системой экспрессии для условной комплементации в B. subtilis.

1.3. Векторы для клонирования промоторов

Наиболее удобные и универсальные системы созданные для изученияактивности промоторов invivoпредставляют собой плазмиду, несущую ген лишённый промотора, кодирующий продукты, легко поддающиесяколичественному анализу (ген-репортёр). Фрагмент ДНК, чью промоторнуюактивность необходимо проанализировать, можно вставить перед геном репортёром.По выходу продукта гена затем можно определить активность данного промотора.Для грамположительных бактерий сконструировано ряд плазмидных векторов дляизмерения активности промоторов, где в качестве гена-репортёра выступает ген b

-галактозидазыили хлорамфеникол ацетилтрансферазы (без промоторов). Главным недостатком этихвекторов является их высокая копийность, что мешает их использованию для точногоизмерения активности промотора invivo. кроме того, они часто имеютузкий круг хозяев.

Создан мобилизуемый малокопийныйчелночный вектор pTCV-lac(PoyartC., Tieu‑Cuot., 1997) с широким кругом хозяев.

Вектор сконструирован на основе двух репликонов — pACYC184 и pAMb

1(рис.6), что позволяет ему реплицироваться в клетках E. coli и в широком кругеграмположительных бактерий (Bacillus,Enterococcus, Listeria, Streptococcus). Точканачала переноса плазмиды RK2обеспечивает способность к переносу приконъюгации из клетки-донора E. coli в различныеграмположительные бактерии. Роль гена-репортёра выполняет ген b‑галактозидазы(без промотора). Вектор присутствует в клетках в количестве 3-5 копий нахромосому; данная малокопийность позволяет точно измерять активность промоторов.

Рис. 6. Структура вектора pTCV-lac. oriRpACYC184 и oriRpAMb

1- rep-области плазмид pACYC184 и pAMb1,соответственно; ermB — ген устойчивости к эритромицину; aphA-3 — ген устойчивости к канамицину; lacZ безпромоторный ген, кодирующий b-галактозидазу,с сайтом связывания рибосомы для грамположительных бактерий (spoVG); oriTRK2, точка начала переносаплазмиды RK2.

Cконструированныйвектор был использован для сравнения активности четырёх промоторов(Ptac, Ptrc, Pspac, PaphA-3) в двухграмположительных палочках (B. subtilis и Listeriamonocytogenes) и двухграмположительных кокках (Enterococcusfaecalisи Streptococcusagalactiae).Для этого осуществлялась вставка фрагментов EcoRI-BamHI в линеаризованный путёмрестрикции рестриктазами EcoRI и BamHI вектор. Во всех данныххозяевах производные вектора оказались стабильными. Показано, что активностьисследуемых промоторов, измеренная путём определения активности b

-галактозидазы,сильно варьирует в зависимости от вида хозяина, в котором исследуетсяактивность данного промотора. Эти данные показывают, что вектор pTCV-lac можно успешно использовать дляанализа регуляции генов в широком круге грамположительных бактерий.

1.4.Векторы с регулируемой копийностью

Сконструированы векторы для грамположительных бактерий, позволяющиеуменьшать количество их копий на клетку (Renault etal., 1996). Эти векторысозданы на основе pILnew — малокопийного вектора, построенного на основе репликона pAMb

1,несущего ген резистентности к эритромицину и способного реплицироваться в большинствеграмположительных бактерией. Этот вектор, как и все полученные из негопроизводные, несут репликационный регион pAMb1,содержащий необходимый для репликации ген repE(кодирует белок репликации RepE) и его регулятор copF. Ген copF был инактивированпутём введения вставки в уникальный сайт KpnI.Так как продукт copFоказывает репрессирующее действие на экспрессию repE, его инактивация ведёт кувеличению копий плазмид на клетку примерно в 20 раз. Первоначальное состояниемалокопийности может быть восстановлено с помощью удаления вставки путём еговырезания из KpnI и последующей сшивки.Вектор pILnew был использовандля создания (1) клонирующих векторов, (2) векторов для изучения регуляции геновпутём клонирования их промоторов и сайтов связывания с рибосомой, (3) векторовдля экспрессии генов, (4) кассет, содержащих репликон с различнымиполилинкерами, которые способствуют созданию новых векторов.

Рис. 7. Структура векторов.Обозначения сайтов рестрикции: E(EcoRI); B (BssHII);N (NdeI); K (KpnI); B (BglII).Em и Cm – гены устойчивости кэритромицину и хлорамфениколу, соответственно. repE – ген, кодирующий необходимый длярепликации белок RepE; orfD – ген-регулятортранскрипции repE; сopF — ген репрессора (CopF) транскрипции кластера repE‑orfD; PorfD-repE — промотор кластера repE-orfD; Pres — промотор гена резольвазы resb

.MCSpBS-часть MCS плазмиды pBluescript; oriC — репликационныйрегион pBluescript.

Для того чтобы спомощью pILnew можно было осуществлятьклонирование, в него был введён полилинкер в различной ориентации собразованием клонирующих векторов pJIM2278 и pJIM2279.

Сконструирован ряд векторов, позволяющих измерить активность промоторов спомощью бактериального люциферазного гена из Vibrioharvei в качествегена-репортёра. Данный ген-репортёр обладает рядом полезных свойств: высокаячувствительность, возможность быстрого измерения активности, отсутствие фоновойактивности в грамположительных бактериях. Были использованы два варианта геновлюциферазы. В первом случае применялся кластер генов luxA и luxB (luxA/B), во втором — продуктслияния генов (luxAB).Преимущество системы luxA/B над luxAB заключается в еёвысокой термоустойчивости (luxABинактивируется при температуре выше 37°

C) и в отсутствии токсичности в E. coli, что позволяетсоздавать конструкции в этом удобном промежуточном хозяине перед их переносом вокончательного хозяина. Однако эти гены могут слабо транслироваться в некоторыхграмположительных бактериях, и использование слитых luxAB генов значительно улучшаетчувствительность системы в некоторых хозяевах.

Векторы pJIM2366и pJIM2367 содержат luxA/B гены дистальнее полилинкера и двунаправленныйтерминатор hisоперона Lactococcuslactisдляпредотвращения транскрипции с проксимально расположенных промоторов. В данныхвекторах было успешно протестировано ряд промоторов из L. lactis при низком и высоком числекопий вектора (промоторы оперонов mle, hisи ald из L. lactis).

Активность многих геноврегулируется на уровне трансляции. Поэтому была создана версия

luxAB гена, позволяющаяизучать эффективность сайтов связывания с рибосомой (RBS) для инициации трансляции. Дляэтого на уровне инициаторного кодона гена luxAB былвведён сайт NdeI, что позволило осуществлятьвставку RBSсразу перед стартовым кодоном этого гена. Транскрипция гена luxAB при этом можетинициироваться с промоторов, расположенных проксимальнее. Вектор pJIM1715, содержащий слитый ген luxAB без RBS не проявлял люциферазнуюактивность. В данный вектор была осуществлена вставка различных фрагментов генаaldBL. lactis, RBS (конструкция pJIM1723), RBS и анти-RBS (pJIM1728), а также RBS и промотор данного гена (pJIM1726). Данные, полученные с помощьюуказанных конструкций, показали, что pJIM1715 можно успешно использовать для изучениятрансляционной эффективности RBS.

Часто необходимо, чтобы синтезпродукта гена шёл на определённом уровне. Для достижения этого можно использоватьрегулируемые промоторы различной силы. Изменение дозы гена предоставляетдополнительный уровень контроля экспрессии гена. Чтобы показать, что для этойцели можно использовать производные

pILnew, в pJIM2279была осуществлена вставка lux генов и была измерена люциферазная активность принизком и при высоком числе копий вектора. При этом сначала измеряласьактивность экспрессии с промоторов расположенных в pJIM2279 проксимальнее MCS (промотор кластера orfD-repE и промотор гена резольвазы), азатем с промоторов клонированных в pJIM2366 и pJIM2367(см. выше). Данные показали, что наблюдаетсячёткая корреляция между дозой гена (количество копий вектора на клетку) иуровнем люциферазной активности. Был сконструирован клонирующий вектор pJIM2375, содержащий промотор mleS для конститутивнойэкспрессии на среднем уровне в L.lactis, RBS и сайт дляклонирования NdeI.

еще рефераты

Еще работы по биологии

Культивирование бактерий

29 Августа 2013

Реферат по биологии

Физиологическое значение меди в жизнедеятельности растений

29 Августа 2013

Реферат по биологии

Стрекозы: их видовой состав, образ жизни

29 Августа 2013