Реферат: Анаэробные сообщества микроорганизмов, разрушающих ароматические ксенобиотики
Московскийгосударственный университет им.М.В. Ломоносова
Биологический факультетКафедра микробиологииРефератАнаэробные сообщества микроорганизмов, разрушающихароматические ксенобиотики.
Выполниластудентка 4-го курса
каф.микробиологии
ЛиньковаЮлия
Руководитель семинара:
А.И.Нетрусов
Москва
2002
Содержание.
1.Введение 32.Биодеградация 3
3.Аэробныйи анаэробный метаболизм ароматических
соединений 5
3.1.Ароматические субстраты и пути их разрушения
в анаэробных условиях 6
4.Синтрофные ассоциации и консорциумы,
разлагающиеаминоароматические вещества. 7
5.Технологический аспект 11
6.Заключение 12
7.Список использованной литературы 13
1.Введение.
С развитием химическойпромышленности в биосферу стало поступать более тысячи различных ксенобиотиков, которые в значительной степени загрязняют окружающую среду. Известно, что соединения, вносимыечеловеком в окружающую среду в последнее время (инсектициды, гербициды,детергенты и другие ксенобиотики) помимо того, что очень токсичны, ещё иустойчивы в среде (что представляет опасность для человека и животных).В настоящее время нагрузка наестественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, и параллельнос деструкцией загрязнений идёт их постепенное накопление в окружающей среде.Деградация ксенобиотиков микроорганизмами является одной из важных проблемзащиты биосферы.
2.Биодеградация.Биоразрушение (биодеградация) – это преобразование сложных веществ спомощью биологической активности. Это широкое понятие включает три
более узких процесса: 1) трансформацию, или незначительные изменениямолекулы; 2) фрагментацию, или разложение сложной молекулы на более простыесоединения и 3) минерализацию, или превращение сложного вещества в самыепростые (Н2О, СО2, Н2,NH3, CH4 и т.д.).Основными биологическими агентами, осуществляющими биоразрушения, являютсямикроорганизмы, обладающие огромным разнообразием ферментных систем и большойлабильностью метаболизма. Именно они способны разлагать широкий спектрхимически устойчивых соединений, тем самым возвращая основные питательныеэлементы в глобальные циклы и предотвращая накопление «мертвых» остатков наповерхности Земли.
Наиболее активно участвуют в разрушении ксенобиотиков бактерии и грибы,основное количество которых выделено из почвы и воды.Представители бактерий относятся к различным родам Грам-отрицательных иГрам-положительных аэробных и анаэробных организмов. Из наиболее важныхаэробных Грам-отрицательных бактерий следует отметить виды родов Pseudomonas, Sphingomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Acinetobacter,Flavobacterium, метанокисляющие и нитрифицирующие бактерии, а из Грам-положительных – представителей родовArthrobacter, Nocardia, RhodococcusиBacillus.
Некоторыевиды нитрат — и сульфатредуцирующих бактерий, а такжеметаногенные археи активно участвуют в анаэробной деградацииксенобиотиков. Грибы, способные аэробно разрушать такие соединения, относятся к родам Phanerochaete (возбудители «белой гнили»), Penicillium, Aspergillus,Trichoderma, Fusarium(Шлегель,1987).
Особую актуальность разрушающая способностьмикроорганизмов приобрела в последние десятилетия в связи с увеличивающимся присутствиемв биосфере устойчивых загрязнителей антропогенного происхождения, причемнередко в масштабах, превышающих природную самоочищающуюспособность. Дело в том, что человеку удалось создать такие соединения, которыене разрушаются в природе в обычных условиях.Это различные синтетические полимеры, красители, пестициды,фармацевтические препараты, моющие средства и т.д. Эти чужеродныевещества (ксенобиотики) имеют уникальнуюбиологическую активность уже на уровне микропримесей.В широком смысле к ксенобиотикам могут быть отнесеныи вещества природного происхождения, но полученные в сверхколичествахи перемещенные в несвойственные им места (например, нефть). Большинство такихсоединений обладает значительной стабильностью, и для их полного разложения приобычных условиях требуются столетия. Происходит непрерывный перенос этихвеществ по пищевым цепям и их накопление на конечных этапах, к которымотносится и человек. Огромное число ксенобиотиковчрезвычайно токсично и проявляет мутагенную, канцерогенную, аллергеннуюи тератогенную активности. Однако понятно, чточеловечество не может полностью отказаться от использования таких веществ, таккак они применяются практически во всех областях деятельности. Поэтому напервый план выходит использование биоразрушающейспособности микроорганизмов для очистки окружающей среды от антропогенныхзагрязнителей.3.Аэробный и анаэробный метаболизм ароматических соединений.
Существует два типа метаболизма ароматических субстратов, аэробный ианаэробный. Аэробная деградацияпростых ароматических соединений инициируется введением в молекулу одной илидвух гидроксильных групп под действием моно- или диоксигеназ. Далее катехолподвергается орто — или мета-расщеплению ароматическогокольца с образованием соответствующих производных муконовойкислоты. Эти неароматические продукты дальше окисляются с использованиемреакций общих метаболических путей до воды и углекислоты. Если на бензольном кольце имеются заместители, то они могутпреобразовываться и отщепляться как до, так и после раскрытия кольца.Разложение ароматических кислот может начинаться с неокислительного декарбоксилирования, приводящего к образованию фенолов,которые затем окисляются в линейные непредельные дикарбоновыекислоты (Elder,1994;Heider,1997).Основнымимикроорганизмами, разрушающими в аэробных условиях простые ароматическиесоединения, являются представители родов Pseudomonas, Alcaligenes,Bacillusи грибы рода Aspergillus, широко распространенные в почвенных и водных экосистемах.
В анаэробных условиях, при отсутствиитакого окислителя как кислород, разрушение ароматических веществ происходитболее сложно, в многоэтапном процессе при участии различных ферментов. Микроорганизмы способны использовать широкий наборароматических субстратов в нитрат-, сульфат-, железо- и карбонат-восстанавливающихусловиях. Основными этапами процесса биодеградацииявляются активирование бензольного кольца, его разрыви образование С1 — и С2-соединений. Активирование кольцаможет быть результатом реакций карбоксилирования,анаэробного гидроксилирования и образования КоА-тиоэфиров ароматических кислот.В последней реакции участвуют растворимые,неспецифичные, индуцибельные КоА-лигазыили КоА-трансферазы. Центральным интермедиатом процесса биодеградацииароматических соединений является бензоил-КоА,который подвергается серии последовательных восстановленийпод действием бензоил-КоА-редуктазы игидролитическому расщеплению образовавшегося производного циклогексана.Первым неароматическим продуктом является пимелил-КоА. Далее происходит ряд окисленийи декарбоксилирование глутаконил-КоАс образованием в конечном счете ацетил-КоА(Heider,1997;Kleerebezem,1999;Lochmeyer,1992).Лишь немногиемикроорганизмы, способные к биодеструкцииароматических соединений, выделены в виде чистых культур. Это Pseudomonassp., Thauera aromatica, T. chlorobenzoica,Desulfobacteriumanilini, Azoarcus evansii, Magnetospirillum sp., Delftia acidovorans,Rhodopseudomonas palustris,Syntrophus gentinae иS. buswellii.Значительно больше сведений о биодеградации таких соединений анаэробными микробными сообществами. В метаногенных условиях конечные стадии биодеструкции представлены археями родов Methanobacterium, Methanospirillum,Methanosarcina, Methanosaeta.
Биодеструкцияповерхностно-активных веществ типа алкилбензолсульфонатов,имеющих в алкильной цепи от одного до трех атомовуглерода, начинается с сульфонатной группы, а усоединений с бóльшим числом атомов – с боковойцепи. В аэробных условиях такие соединения разлагаются бактериями и грибами,способными к деструкции ароматических соединений. В отсутствие кислорода разрывC-S-связи сульфоароматическихсоединений могут проводить бактерии с бродильным типом метаболизма. Процессыанаэробной деградации алкилбензолсульфонатовэффективней идут в сообществе, содержащем микроорганизмы родов Clostridium,Desulfovibrio,Methanobacterium, Methanosarcina.
3.1.Ароматическиесубстраты и пути их разрушения в анаэробных условиях.
Микроорганизмы-денитрификаторымогут использовать п-крезол, ванилат,катехол, анилин, нитробензол, хлорбензоат, бензиловый спирт, толуол, этилбензол, а также аминокислоту фенилаланин.
Синтрофныеметаногенные ассоциации (Syntrophusbuswellii,S.gentianae) разлагают бензоат,кротонат, гентизат игидрохиноны.
Thaueraaromatica и Azoarcus evansii используют 2- и 4-аминобензойные кислотыи их тиоэфиры. Помимо этого, могутбыть использованы толуол, фенол, фенилпируват, фторзамещённая ароматика, фенилацетальдегид, фенилглиоксилат, алкилбензолы, терефталат и др.(Kleerebezem,1999;Lochmeyer,1992).
4.Синтрофные ассоциации и консорциумы,разлагающие аминоароматическиевещества.
Синтрофизм—особый случай симбиотической кооперации между метаболически разными типами бактерий, которые зависят друг от другапри разрушении субстратов.
Термин“консорциум”используется для описания различных коопераций микроорганизмов.В примечании к Правилу 31 в “Международном кодексе номенклатуры бактерий”(1978) говорится:”Консорциум—это совокупность или ассоциация двух или более организмов”.Такимобразом, в это понятие входят и такие формы сообществмикроорганизмов, как ассоциация и смешанная культура.
Примеромконсорциумаможет служить “Methanobacillus omelanskii”(2 организма-партнёра,штамм Sи штаммМ.о.Н.).:
Штамм S: 2 EtOH+ 2H2O = 2CH3COO--+ 2 H++ 4 H2 ΔGº=+19 кДж/2 моль EtOH
Штамм M.о.Н.:4H2 + CO2=CH4 + 2 H2O ΔGº=-131 кДж/1 моль CH4
Сообщество:2EtOH+ CO2 =2CH3COO--+ 2 H+ +CH4 ΔGº=-112кДж/1 моль CH4
В данномслучае 2 штамма кооперируются для превращения этанола в ацетат и
метан, при этом происходитмежвидовой перенос водорода. Штамм S неможет
растина этаноле в отсутствие штамма M.o.H., потребляющего водород, т.к.реакция
пристандартных условиях эндотермична.Таким образом, ниодин из партнёров не
можетрасти самостоятельно на этаноле, и деградацияэтилового спирта зависит от
кооперации двух штаммов(Schink,1997).
<img src="/cache/referats/13293/image002.jpg" v:shapes="_x0000_s1026">
Рис.1. Общаясхема потока углерода и электронов в трофических связях микроорганизмов, участвующих в метаногенной деградации органических веществ в анаэробных условиях.
1-первичные бродильщики;2-водородокисляющие метаногены; 3-ацетатпотребляющие метаногены; 4-вторичные бродильщики; 5-ацетогенные бактерии. (Schink,1997).
Данная схема применима и к анаэробным сообществам микроорганизмов,
разлагающихаминоароматические субстраты.
Разделение метаболических функций и ихраспределение среди метаболически разныхмикроорганизмов является компенсацией отсутствия эффективных механизмовдеградации в аэробных условиях.Метаболические взаимодействия кооперированных сообществ зависят от переносаметаболитов между партнёрами. Поток Н2 обратно пропорционаленрасстоянию между водородобразующими бактериями и водородпотребляющими метаногенами.Оптимальная скорость переноса метаболитов достигается в случае тесного контактапартнёров: непосредственного соседства, образования агрегатов или “флокков”.Подобные флокки образуются, например, у бактерий, разлагающих жирные кислоты.Образование таких структур требует времени (иногда даже месяцев)(Schink,1997).
В настоящее время ведутся работы по изучению анаэробныхмикробных сообществ, разлагающих аминобензойную и аминосалициловую кислоты и их изомеры ( Калюжный, 1998; Савельева и др.,1999; Тян и др.,1999). Эти вещества в окислительных условиях полимеризуются в трудноразлагаемые макромолекулы, что усложняет ихразложение, а аэробная деградация приводит к образованию ряда токсических промежуточных продуктов.
Этиисследования проводятсяна консорциумах, выделенных из мезофильного и термофильного илов. Получено стабильное метаногенное сообщество, способноепотреблять 2-АВА(2-аминобензойная кислота) с высокой скоростью. В качестве промежуточных продуктов образуются бензоат, ацетат и СО2. Предполагается,что эта культураявляется первичным анаэробным деструктором 2-АВА в выделенном из мезофильногоила стабильном метаногенном сообществе (Савельева и др., 1999).
Изтого же мезофильного ила получено стабильное анаэробное сообщество, способное разлагать 4-АВА с образованием метана.Промежуточные продукты деградации те же,что и в случае анаэробного разложения 2-АВА. Из этого консорциумавыделена чистая культура первичного деструктора 4-АВА (Савельева идр.,1999). В настоящее времяведутся работы по получению стабильнойнакопительной культуры и выделению из неё чистойкультуры микрорганизмов, разрушающих 5-ASA(5-амносалициловой кислоты)и 3-АВА в термофильных условиях.
Из стабильного консорциума были полученыкультуры факультативных анаэробов, окисляющих 5-ASAи салициловую кислоты в анаэробных условиях с образованием пропионата,ацетата, СО2, иногда бутирата и водорода.Считается, что во всех этих сообществах первичным деструктором является 1 и тотже микроорганизм (Савельева и др., 1999; Тян и др.,1999).
Подобные взаимоотношения были описаны в статье N.C.G.Tan(Tan et al.,1999) для анаэробного гранулированного ила, разлагающего азокрасители.В процессе деградации азосоединений происходит восстановление азо-связи с образованием различных ароматических соединений (в т.ч.и с аминозаместителями).Данныйконсорциум использует другую стратегию деградации субстрата (в 2 этапа). Первый этап, анаэробный, восстановление азо-красителей до ароматических аминов, второй, аэробный, дальнейшийраспад ароматических соединений. Второй этап осуществляется аэротолерантными микроорганизмами,которые обитают на периферии анаэробногобиотопа. Интеграция аэробных и анаэробных условий является благоприятной для биоминерализации азотсодержащих ксенобиотиков(Tan.et al.,1999).
Метаногенныеконсорциумы участвуют также в деградации такого соединения, как толуол. В состав такого сообществавходят представители царств Бактерий и Архей. Филогенетический анализ доминирующих организмов показал, что в состав данногоконсорциума входят два вида архей,относящихся к родам Methanosaeta, Methanospirillum, а также один из видов рода Desulfotomaculum.Остальные представители сообщества не были определены, ноих вклад в общий метаболизм весьма важен, т.к. при отсутствии какого-либо компонента в сообществеизменяется количественный и качественный состав (Ficker еt al.,1999).
Помимо этого, существуют сообществамикроорганизмов, состав которых ещё полностью не известен, но есть данные об ихспособности разлагать ароматическиесубстраты. На электронных микрофотографиях представителей таких сообществ виднотесное соседство крупных и мелких клеток. Они принадлежат разным организмам, ноих расположение свидетельствует об их возможной связи через метаболизм. Обычноэти микроорганизмы трудно выделяются вчистые культуры (Fickerеt al.,1999).
Описана культура микроорганизмов, осуществляющуюдеградацию о-фталата(Kleerbezem,1999). В культуреприсутствовали 2 основных типа микроорганизмов: короткие толстые палочки ималенькие палочки. Толстые ответственны за ферментацию. Маленькие палочки располагались очень близко к толстым и, возможно, являлись метаногенами,потребляющими водород (Methanobacterium). Иногда обнаруживаются споровые палочки, которые, скореевсего, выполняют роль деструкторов (первые стадии деградации). Идентификация дочистых культур не производилась (Kleerbezemet al.,1999).
ЩербаковойВ.А. былоисследовано сообщество, выделенноез полупромышленного UASB-реактора.В разрушении бензолсульфонатаи п-толуолсульфоната(ТС)принимают участие 9-10 микроорганизмов, 5 из которыхудалось выделить в чистые культуры.Чтобы определитьключевые группы микроорганизмов, участвующие вразрушении ТС до метана, было изучено изменение микробной популяции во время процесса.В первые сутки роста основную часть популяциисоставлял спорообразующий организм штамм 14 (68.5 %). Во вторые сутки егочисленность уменьшилась, однако в сообществе преобладали клостридиальныештаммы (80.5%). В дальнейшем наблюдалось увеличение численности штамма SS(спорообразующий организм).С третьих сутокнаблюдалось активное спорообразование у клостридиальныхштаммов, начинался рост численности у метанобразующих микроорганизмов, ик концу первой недели их суммарная численность составляла около 60 % общейпопуляции.Скачок в потреблении п-толуолсульфонатаможно соотнести с ростом численности штамма SSв популяции микробов на третьи сутки процесса. Во время развития сообщества происходило,наряду с образованием метана, накоплениелетучих жирных кислот. Содержание ацетата в культуральнойжидкости было на порядок выше, чем концентрация других. Так, на начальныхэтапах n-толуолсульфонат используется бактериями рода Clostridium какисточник углерода и серы, бактериями рода Desulfovibrio как акцептор электронов.А сразу после появления ацетата толуолсульфонат используется метаносарцинойв качестве стимулирующей органической добавки.Толуолявляется промежуточным продуктом деградации толуолсульфоната.Другимважным интермедиатом процесса является изобутират. Кроме выделенного в чистую культуру Methanobacteriumformicicum штамм МН, образующего метан из СО2 и Н2,важную роль в исследуемом сообществе играет другой метаногенрода Methanospirillum.Это наиболеераспространённые партнёры в синтрофных организациях,способные расти при низких парциальных давлениях водорода(Щербакова,2000).
Чтобы грамотно использовать процессы анаэробнойдеградации в биотехнологических целях, необходимопонимать внутренние взаимосвязи в сообществе.
5.Технологическийаспект.
В настоящее время исследования по биодеградациизагрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. При этомиспользуются разнообразные технологические схемы биореакторовдля очистки водоёмов, атмосферы, почв (Deriellet al.,1999).
Биореакторы — это модели биологических систем. Изначально в нихиспользовались естественно сложившиеся консорциумы микроорганизмов, которыепотребляли субстрат и выдавали продукт, без учёта видового состава ивзаимодействий между различными видами микроорганизмов внутри консорциума.
В некоторых случаях процесс деградации происходитболее эффективно, если вслед за анаэробной фазой следует анаэробная, в котороймогут участвовать, к примеру, аэротолерантные микроорганизмы(O’Neill etal.,2000). В этой статье описан UASB(UpflowAnaerobic Sludge Blanket)—реактор,используемый для деградации азо-красителей. Впроцессе культивирования и накопленияопределённых продуктов микроорганизмами изучаемого ила чередовались анаэробныеи аэробные стадии (O’Neill et al.,2000).
В работах по изучению биодеградацииаминобензойной или аминосалициловойкислот в биореакторах основным “рабочим элементом” являлся мезофильный или термофильный ил очистных сооружений, адаптированный к определённому субстрату (Kalyuzhnyi etal.,1998).
В настоящее время ведутся активные исследования внаправлении изучения состава различных синтрофных ассоциаций, деградирующихконкретный субстраты, и увеличения эффективности процесса.
6.Заключение.
Аминоароматические ксенобиотики—трудноразлагаемыемакромолекулы, обладающие свойством накапливаться в экологических нишах. Омикробных сообществах, их разрушающих, известносравнитедьно немного, особенно о функцияхкомпонентов, связи их между собой, таксономической принадлежности микроорганизмов.Анаэробные микроорганизмы являются первичными деструкторами гетероциклических иароматических соединений. Перерабатывая сложные субстраты, ониобразуют продукты, потребляемые синтрофнымимикроорганизмами. На конечных этапах деградации субстратов важную роль в синтрофныхконсорциумах играют сульфатредукторы, метаногены и ацетогены.Они потребляют одно- и двухуглеродныесубстраты и водород, выделяя конечные продукты, таким образом участвуя в возвращении углерода идругих компонентов аминоароматических субстратов вкруговорот веществ в биосфере.
7.Списокиспользованной литературы.
1.<span Times New Roman"">
О.В., Котова И.Б., НетрусовА.И.,2000.Сборниктрудовнаучной конференции “Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов”.МГУ, Диалог,2000.2.<span Times New Roman"">
ТянА.Т., БрюхановА.Л., Котова И.Б., НетрусовА.И.2000. Сборник трудовнаучной конференции “Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов”.МГУ, Диалог,2000.3.<span Times New Roman"">
В.А.Автореферат диссертации на соискание учёнойстепени канд. биол. наук. Пущино,2000.4.<span Times New Roman"">
Г.Общая микробиология.М., Мир,1987.5.<span Times New Roman"">
Elder D.J.E.,D.J.Kelly.Thebacterial degradation of benzoic and benzenoidcompounds under anaerobic conditions: Unifying trends and new perspectives.Microbiology Reviews,1994,vol.13,p.441-4686.<span Times New Roman"">
DerielE.,ComeauJ.,Villemur R. Two-luquid-phasebioreactors for enchanceddegradation of hydrophobic/toxiccompounds.Biodegradation,1999,vol.10,p.219-233.7.<span Times New Roman"">
FickerM., Krastel K., Orlicky St.,Edwards E. Molecular characterization ofa toluene-degrading methanogenic consortium//Appliedand Environmental microbiology,1990,p.5576-5585.8.<span Times New Roman"">
HeiderJ., FuchsG. Microbial anaerobic aromatic metabolism. Anaerobe,1997,vol.3,p.1-22.9.<span Times New Roman"">
KalyuzhnyiS.V.,SclyarV.I., Mosolova T.P., Kucherenko I.A., Degtyarova N.N., Russkova I., Kotova I.B., Netrusov A.I. Methanogenic biodegradationof selected aminobenzoates.INTAS—1999—1809.10.<span Times New Roman"">
KleerebezemR.,Look W.Hulshoff Pol, Gatze Lettinga. Anaerobicdegradation of phthalate isomers by methanogenic consortia.Applied and evironmentalmicrobiology,1999,vol.65,№ 3,p.1152-1160.11.<span Times New Roman"">
KleerebezemR.,Look W.Hulshoff Pol, Gatze Lettinga. The role ofbenzoate in anaerobic degradation of terephthalate.Applied and evironmental microbiology,1999,vol.65,№3,p.1161-1167.12.<span Times New Roman"">
LochmeyerC.,Koch J.,Fuchs G. Anaerobic degradation of 2-aminobenzoic acid ( anthranilic acid) via benzoyl-coenzymA and cyclohex-1-encarboxyl-CoA in a denitrifying bacterium.J.Bacteriol,1992,vol.174,p.3621-3628.13.<span Times New Roman"">
O’Neill C.,LopesA.,Esteves S., Haw Kes F.R.,Hawkes D.L.,Willox S. Azo-dye degradation in an anaerobic-aerobic treatment system opeatingon simulated textile effluent. Appl MicrobialBiotechnol,2000,vol.53,p.249-254.14.<span Times New Roman"">
SchinkB. Energeticsof syntrophic cooperation in methanogenicdegradation.Microbiology and Molecular Biologyreviews,1997,p.262-280.15.<span Times New Roman"">
Tan N.C.G., Prenafeta-BolduF.X., Opsteeg J.L., Lettinga G.,Field J.A. Biodegradation of azo-dyes in cocultures ofanaerobic granular sluge with aerobic aromatic aminedegrading enrichment cultures.Appl MicrobialBiotechnol,1999,vol.51,p.865-871.